劉慧 謝海霞 徐惠平 王建中

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是世界范圍內(nèi)最常見的慢性關(guān)節(jié)疾病，基因、性別、年齡等多種因素均會(huì)影響其發(fā)生、發(fā)展[1]，但具體病因尚不明確。OA的主要病理改變包括關(guān)節(jié)軟骨組織發(fā)生退行性病變和變形、關(guān)節(jié)滑膜炎癥、軟骨下骨硬化及骨贅形成等，隨病程進(jìn)展，受累范圍可逐漸發(fā)展至全關(guān)節(jié)[2]。臨床治療OA 通常采用非藥物和藥物聯(lián)合治療，并轉(zhuǎn)向預(yù)防，長(zhǎng)期目標(biāo)為降低患病風(fēng)險(xiǎn)和減緩疾病進(jìn)展[3]。非甾體抗炎藥物是當(dāng)前治療和預(yù)防OA 的首選西藥，但長(zhǎng)期服用易產(chǎn)生胃腸道反應(yīng)和心腦血管損傷，因此患者難以長(zhǎng)期堅(jiān)持[4]。中醫(yī)根據(jù)“急則治其標(biāo)，緩則治其本”原則，使用補(bǔ)肝腎氣血的中藥成分來(lái)強(qiáng)筋健骨、通絡(luò)止痛[5]，具有不良反應(yīng)較少、臨床有效率高、見效快等優(yōu)點(diǎn)[6]。強(qiáng)筋合劑為浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院院內(nèi)制劑，由已故名老中醫(yī)錢世勛先生根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)方匯總而來(lái)，臨床用于治療腰肌勞損，療效良好且未見不良反應(yīng)[7]，在OA 治療上也有一定療效。本研究建立OA大鼠模型，觀察強(qiáng)筋合劑對(duì)OA 的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠 Wistar 雄性大鼠（6～8 周齡，120±20 g）共36 只，購(gòu)自浙江鷹旸醫(yī)藥研發(fā)有限公司動(dòng)物中心，動(dòng)物使用SYXK 許可證號(hào)：（浙）2020-0024。飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)均在浙江鷹旸醫(yī)藥研發(fā)有限公司動(dòng)物中心進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)浙江鷹旸醫(yī)藥研發(fā)有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：ZJEY-20220124-02）。

1.1.2 主要試劑 強(qiáng)筋合劑（批號(hào)：浙藥制Z20100176），配方：杜仲葉、續(xù)斷（炒）、丹參、淫羊藿、狗脊（制）、熟地黃、五加皮、雞血藤各50 g，白芍38 g，骨碎補(bǔ)25 g，以上10 味，加水1 200 mL 煎煮2 次，合并煎液濃縮至500 mL，制得成品為500 mL/瓶，使用時(shí)加蒸餾水稀釋。大鼠IL-1β ELISA 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：MM-0047R2）購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-13 抗體（批號(hào)：AF5355）、環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）-2抗體（批號(hào)：AF7003）、Ⅱ型膠原蛋白（CollagenⅡ）抗體（批號(hào)：AF0135）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)：AF7021）購(gòu)自美國(guó)Affinity Biosciences 公司；二奎啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（批號(hào)：pc0020）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；RIPA 裂解液（批號(hào)：P0013D）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（批號(hào)：10600023）購(gòu)自美國(guó)GE Health care Life 公司；總RNA 抽提試劑（total RNA extraction reagent，Trizol）（批號(hào)：B511311）購(gòu)自生工生物工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：CW2569）購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備、分組及處理 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、強(qiáng)筋合劑低劑量組、強(qiáng)筋合劑中劑量組、強(qiáng)筋合劑高劑量組和鹽酸氨基葡萄糖組。按1∶1 體積比將10%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L L-半胱氨酸配制成混合液備用。在實(shí)驗(yàn)第0、3、6 天，對(duì)照組大鼠膝關(guān)節(jié)腔注入0.2 mL 0.9%氯化鈉溶液，其余各組大鼠膝關(guān)節(jié)腔均注入0.2 mL混合液。各組以灌胃方式給藥4 周：對(duì)照組和模型組均給予0.9%氯化鈉溶液10.0 mL/（kg·d），低、中、高劑量組分別給予體積分?jǐn)?shù)為21.2%、43.5%、86.9%的強(qiáng)筋合劑10.0 mL/（kg·d），鹽酸氨基葡萄糖組給予13 g/L 的鹽酸氨基葡萄糖溶液10.0 mL/（kg·d）。4 周后，各組大鼠麻醉后心臟取血0.8～1.0 mL，取得的血液樣本3 500 r/min 離心15 min，分離得到血清。大鼠取血后頸椎脫臼處死，解剖并迅速剝離各組大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，打開膝關(guān)節(jié)腔解剖得到關(guān)節(jié)軟骨組織。血清、膝關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)軟骨組織于低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大鼠關(guān)節(jié)腫脹度變化的觀察 觀察并記錄實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的變化。游標(biāo)卡尺測(cè)量造模前、給藥前以及給藥第1、2、3、4 周各組大鼠膝關(guān)節(jié)寬度。計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹度（mm）=各測(cè)量時(shí)膝關(guān)節(jié)寬度-造模前膝關(guān)節(jié)寬度。測(cè)量3 次，取平均值。

1.2.3 大鼠血清中IL-1β 水平檢測(cè) 采用ELISA 法。取大鼠血清，根據(jù)ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書方法，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)下各孔的吸光值，計(jì)算各組大鼠血清中IL-1β 水平。重復(fù)6 次，取平均值。

1.2.4 大鼠軟骨組織MMP-13、COX-2、Collagen Ⅱ蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blot 法。取適量大鼠軟骨組織樣本，剪碎后加入1 mL裂解液，混勻，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，提取組織蛋白。BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。5%脫脂奶粉振蕩封閉2 h，清洗3 次。PVDF 膜放入含COX-2、Collagen Ⅱ、MMP-13 等抗體的稀釋液中，4 ℃搖床振蕩孵育過(guò)夜。室溫振蕩30 min，用5%脫脂奶粉封閉。加入二抗反應(yīng)液，洗膜。化學(xué)發(fā)光儀顯影，Chemi capture 軟件處理，以GAPDH 為內(nèi)參，根據(jù)條帶灰度值計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 大鼠軟骨組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）mRNA 表達(dá)的檢測(cè) 采用qPCR 法。取適量大鼠軟骨組織，使用Trizol 提取軟骨組織總RNA。室溫，12 000 r/min 離心10 min。取上清液，與氯仿混勻，離心5 min。取出上清液與異丙醇混合靜置15 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，棄上清液。1 mL 無(wú)水乙醇漂洗沉淀，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，棄上清液。重復(fù)上一步操作，室溫干燥10 min。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，基因引物由生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃，10 min 變性；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；循環(huán)40 次。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算TGF-β1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

表1 大鼠TGF-β1 引物序列

1.2.6 大鼠膝關(guān)節(jié)病理改變觀察 采用HE 染色法。取各組大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋后，切成4 μm 厚切片。HE 染色后顯微鏡下觀察、采集分析樣本相關(guān)部位。按病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組大鼠細(xì)胞浸潤(rùn)、骨侵襲和滑膜侵襲等3 方面進(jìn)行評(píng)分[8]：未出現(xiàn)細(xì)胞浸潤(rùn)、骨侵襲和滑膜侵襲為0分；出現(xiàn)輕微的細(xì)胞浸潤(rùn)與滑膜侵襲為1 分；出現(xiàn)骨侵襲為2 分；伴隨骨侵襲出現(xiàn)較為嚴(yán)重的細(xì)胞浸潤(rùn)與滑膜侵襲為3 分；伴隨骨侵襲出現(xiàn)極為嚴(yán)重的細(xì)胞浸潤(rùn)與滑膜侵襲為4 分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，采用Levene 法檢驗(yàn)方差齊性，方差齊多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 法，方差不齊采用Welch 檢驗(yàn)，兩兩比較采用Dunnett 檢驗(yàn)。采用Spearman 秩相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)期各組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度比較 與對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠的膝關(guān)節(jié)腫脹度均顯著增加（均P＜0.01），提示本次實(shí)驗(yàn)的骨關(guān)節(jié)炎大鼠造模成功。給藥第2 周，與模型組相比，強(qiáng)筋合劑高劑量組與鹽酸氨基葡萄糖組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度均顯著降低（均P＜0.05）；給藥第4 周，與模型組相比，強(qiáng)筋合劑高劑量組與鹽酸氨基葡萄糖組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度均顯著降低（均P＜0.01）。低、中劑量強(qiáng)筋合劑治療可以改善OA 大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 不同時(shí)期各組大鼠大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度變化的比較（mm）

2.2 各組大鼠血清IL-1β 表達(dá)的比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IL-1β 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，強(qiáng)筋合劑中、高劑量組與鹽酸氨基葡萄糖組大鼠血清IL-1β 水平均顯著降低（均P＜0.01），提示強(qiáng)筋合劑可降低OA 大鼠血清IL-1β水平，見圖1。

圖1 各組大鼠血清中IL-1β 水平比較

2.3 各組大鼠軟骨組織MMP-13、COX-2、Collagen Ⅱ蛋白表達(dá)的比較 與對(duì)照組相比，模型組大鼠軟骨組織中MMP-13、COX-2 蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高（均P＜0.01）；與模型組相比，強(qiáng)筋合劑中、高劑量組和鹽酸氨基葡萄糖組MMP-13、COX-2 蛋白相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低（均P＜0.05）。與對(duì)照組相比，模型組Collagen Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，強(qiáng)筋合劑中、高劑量組和鹽酸氨基葡萄糖組大鼠軟骨組織的Collagen Ⅱ均顯著升高（均P＜0.01），見表3、圖2。

圖2 各組大鼠軟骨組織中MMP-13、COX-2、Collagen Ⅱ蛋白電泳圖

表3 各組大鼠軟骨組織中MMP-13、COX-2、Collagen Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較

2.4 各組大鼠軟骨組織中TGF-β1 mRNA 表達(dá)的比較 與對(duì)照組比較，模型組、強(qiáng)筋合劑低、中、高劑量組和鹽酸氨基葡萄糖組的大鼠軟骨組織中TGF-β1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（均P＜0.01）；與模型組比較，強(qiáng)筋合劑中、高劑量組和鹽酸氨基葡萄糖組的大鼠軟骨組織中TGF-β1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（均P＜0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠軟骨組織中TGF-β1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較

2.5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)病理學(xué)變化 對(duì)照組大鼠膝關(guān)節(jié)排列規(guī)則整齊，層次清晰可見，關(guān)節(jié)面光滑；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)面粗糙，關(guān)節(jié)軟骨與鈣化軟骨之間的潮線區(qū)破壞嚴(yán)重，可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，排列紊亂。強(qiáng)筋合劑低大鼠膝關(guān)節(jié)可見少量軟骨細(xì)胞被破壞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；強(qiáng)筋合劑中劑量組大鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象少見；強(qiáng)筋合劑高劑量組和鹽酸氨基葡萄糖組大鼠膝關(guān)節(jié)面光滑，少量骨損失，炎癥浸潤(rùn)程度較輕，見圖4。病理評(píng)分結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，模型組評(píng)分顯著上升（P＜0.01）；相比模型組，強(qiáng)筋合劑低劑量組評(píng)分無(wú)顯著變化（P＞0.05），強(qiáng)筋合劑中劑量、高劑量組和鹽酸氨基葡萄糖組評(píng)分均顯著下降（均P＜0.01），見圖5。

圖4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)組織病理檢查所見

圖5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)組織病理評(píng)分比較

3 討論

以往研究表明，炎癥因子及信號(hào)通路異常激活在OA 的發(fā)展中起重要作用[9]。臨床分析表明，OA 患者中血清IL-1β 水平的升高常與病情的嚴(yán)重程度相關(guān)[10-11]，表明IL-1β 或促進(jìn)OA 的發(fā)生、發(fā)展[10]。Zheng等[12]發(fā)現(xiàn)，OA 大鼠體內(nèi)IL-1β 表達(dá)上調(diào)可刺激MMP-13 表達(dá)增強(qiáng)、骨膠原蛋白Ⅰ及Ⅱ含量降低。MMP-13是軟骨退化進(jìn)程中造成軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要蛋白酶，其表達(dá)增加與關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程呈顯著相關(guān)[13]。CollagenⅡ是關(guān)節(jié)軟骨中的重要的成分，其含量下降與OA 的發(fā)展相關(guān)[14]。薛太陽(yáng)等[15]發(fā)現(xiàn)抑制MMP-13 表達(dá)和促進(jìn)CollagenⅡ生成可以減輕大鼠骨關(guān)節(jié)炎。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清IL-1β 水平顯著升高，而強(qiáng)筋合劑中、高劑量組大鼠血清IL-1β 水平顯著降低；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)MMP-13表達(dá)顯著增加，Collagen Ⅱ顯著降低，而強(qiáng)筋合劑中、高劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)MMP-13 表達(dá)顯著下降，Collagen Ⅱ表達(dá)顯著增加。由此表明，強(qiáng)筋合劑具有降低OA大鼠血清IL-1β水平，抑制MMP-13表達(dá)及促進(jìn)CollagenⅡ生成的作用。

TGF-β 亞型及其受體廣泛表達(dá)于軟骨、骨及滑膜組織，起維持關(guān)節(jié)平衡和穩(wěn)態(tài)作用[16-17]。在OA 骨關(guān)節(jié)中，TGF-β 被大量激活并誘導(dǎo)炎癥發(fā)生，加重關(guān)節(jié)組織損傷[18]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠膝關(guān)節(jié)組織內(nèi)TGF-β1 mRNA 水平顯著增強(qiáng)，而強(qiáng)筋合劑中、高劑量組大鼠的TGF-β1 mRNA 水平顯著降低。抑制COX-2生成可以抑制體內(nèi)骨質(zhì)破壞，預(yù)防滑膜增生，起到軟骨保護(hù)作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)COX-2 在模型組大鼠膝關(guān)節(jié)中顯著增加，而在強(qiáng)筋合劑中、高劑量組中顯著下降。以上結(jié)果均表明，強(qiáng)筋合劑具有減輕OA 大鼠關(guān)節(jié)組織炎癥、保護(hù)軟骨的作用。

強(qiáng)筋合劑是本院自主開發(fā)的傳統(tǒng)中藥制劑，補(bǔ)腎健腰、養(yǎng)血活絡(luò)，臨床療效肯定，安全性好。近年來(lái)對(duì)該藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究與控制[20-21]，已有研究證實(shí)，強(qiáng)筋合劑能有效改善骨質(zhì)疏松大鼠股骨形態(tài)學(xué)，增加細(xì)胞數(shù)量，提高骨小梁密度，上調(diào)堿性磷酸酶、骨鈣素表達(dá)水平，且安全性較好[22]。本研究發(fā)現(xiàn)高劑量強(qiáng)筋合劑組的大鼠膝關(guān)節(jié)表面平滑可見少量骨損失，炎癥浸潤(rùn)程度較輕。與模型組相比，強(qiáng)筋合劑中劑量、高劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)組織病理評(píng)分均顯著下降，提示強(qiáng)筋合劑有改善OA 大鼠膝關(guān)節(jié)組織作用。

綜上所述，強(qiáng)筋合劑能夠改善OA 大鼠腫脹關(guān)節(jié)，減輕組織炎癥程度，其機(jī)制可能是強(qiáng)筋合劑通過(guò)降低血清IL-1β 水平，抑制TGF-β1、MMP-13、COX-2蛋白生成，促進(jìn)膠原蛋白Ⅱ生成以達(dá)到OA 關(guān)節(jié)改善的作用。