凌立貞, 李常榮, 張書東

(六盤水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 貴州 六盤水 553004)

隨著農(nóng)藥和化肥在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中的大量使用,農(nóng)用耕地污染問題日趨嚴(yán)重。2014年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》[1]公布的我國農(nóng)用耕地土壤污染點(diǎn)位超標(biāo)率為19.4%,其中輕度、中度和重度污染點(diǎn)位比例分別為2.8%,1.8%和1.1%,而重金屬是其主要污染物,如鎘(Cd)、鎳(Ni)、銅(Cu)、砷(As)、汞(Hg)、鉛(Pb)等。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),我國每年因重金屬污染的糧食高達(dá)1 200萬t,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和糧食浪費(fèi)[2-3]。除人為因素造成的土壤重金屬污染外,重金屬元素還可通過巖石風(fēng)化、森林大火和火山爆發(fā)釋放等自然現(xiàn)象進(jìn)入環(huán)境[4],從而加劇土壤的污染狀況。

在我國,Cd污染點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)7%,Cd已經(jīng)成為我國耕地土壤最嚴(yán)重的重金屬污染物。據(jù)報(bào)道我國農(nóng)田重金屬Cd污染面積已達(dá)2×104hm2,每年有14.6×108kg農(nóng)產(chǎn)品Cd含量超標(biāo),且有日益增加的趨勢[5]。Cd不是植物生長的必需元素,Cd含量過高會(huì)導(dǎo)致植物生長緩慢,光合系統(tǒng)、氣孔運(yùn)動(dòng)、酶活性、蛋白質(zhì)代謝和膜功能發(fā)生異常變化,從而造成葉綠體結(jié)構(gòu)破壞,激化葉綠素分解,阻斷營養(yǎng)元素向上運(yùn)輸?shù)任：6]。此外,土壤中的Cd容易被植物吸收積累,并通過食物鏈進(jìn)入人體,從而危害人類的身體健康[7-8]。Cd超標(biāo)能夠引起肝臟、腎臟、骨骼、生殖、呼吸系統(tǒng)等方面的損害,居住在Cd污染區(qū)的人們患上述疾病的風(fēng)險(xiǎn)性更高[9]。為減少土壤中Cd元素對(duì)植物和人體的傷害,研究人員研發(fā)出了多種土壤修復(fù)技術(shù),部分取得明顯成效并在實(shí)踐中得以應(yīng)用。目前,生物修復(fù)技術(shù)因具有操作簡單、成本低、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于修復(fù)重金屬Cd等污染的土壤[10-11]。在此修復(fù)方式中尋找最佳超富集植物是實(shí)施土壤修復(fù)的關(guān)鍵。紫花苜蓿(Medicagosativa)為豆科苜蓿屬多年生草本植物,可以在缺少營養(yǎng)、鹽堿、干旱等不良環(huán)境條件下生長[12],是廣泛種植的牧草作物,其發(fā)達(dá)根系上的根瘤具有固氮作用,還可以提高土壤肥力。紫花苜蓿對(duì)Cd、Zn、Cu及Ni等多種重金屬元素具有較高的富集功能,在重金屬污染土壤的生態(tài)修復(fù)中起著極為重要的作用[13-14]。

種子萌發(fā)是植物生長起始的重要階段,對(duì)環(huán)境變化感應(yīng)非常敏感。多項(xiàng)研究表明,低濃度Cd脅迫對(duì)植物種子的萌發(fā)沒有明顯的抑制效果,有的甚至提高了種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo),而中高濃度的Cd處理會(huì)明顯降低植物種子的萌發(fā)指標(biāo)。如田丹等[15]研究表明,低濃度的Cd處理(1 mg/L)對(duì)生菜的萌發(fā)無明顯影響,當(dāng)Cd濃度高于10 mg/L時(shí)明顯降低生菜種子的萌發(fā)指標(biāo)。因此,多數(shù)情況下研究人員會(huì)把種子萌發(fā)階段作為植物耐Cd性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵階段。此外,一些研究發(fā)現(xiàn),通過施加外源物質(zhì)可以減輕Cd對(duì)植物的毒害作用。如施加外源檸檬酸(CA)能有效緩解Cd脅迫對(duì)植物生長的抑制,減少活性氧的含量而增加抗性物質(zhì)的含量[16];施加外源3-吲哚乙酸(IAA)能促進(jìn)葉綠素a和葉綠素b的合成,增大光合作用強(qiáng)度和提高抗氧化酶的活性來緩解Cd對(duì)植物的毒害作用[17];適當(dāng)濃度的水楊酸(SA)處理萵苣種子可以緩解Cd對(duì)其種子萌發(fā)和幼苗生長的傷害[18]。

為加大紫花苜蓿在Cd污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用,本研究以高產(chǎn)型維多利亞紫花苜蓿為研究材料,通過在明顯開始抑制紫花苜蓿種子萌發(fā)的Cd濃度下施加三種外源物質(zhì)CA、SA和IAA,檢測施加不同外源物質(zhì)對(duì)Cd脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響。這些研究結(jié)果將對(duì)于紫花苜蓿緩解Cd2+的毒害作用和在重金屬Cd污染土壤開展修復(fù)改良工作具有重要意義,同時(shí),也為其他重金屬富集植物的研究提供借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1材 料

本試驗(yàn)所使用的紫花苜蓿品種為維多利亞,種子購買于藍(lán)天種子公司。

1.1.2主要藥品試劑

氯化鎘(CdCl2)、無水乙醇(C2H6O)、檸檬酸(CA)、3-吲哚乙酸(IAA)、水楊酸(SA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1抑制紫花苜蓿種子萌發(fā)的Cd濃度檢測

挑選飽滿程度一致,無蟲害和不破損的種子,用5%的次氯酸鈉溶液浸泡20 min進(jìn)行消毒后,用蒸餾水沖洗3～5遍,再用75%的酒精消毒5 s后,用蒸餾水沖洗3遍。用濾紙把種子上的水吸干備用。

在培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中鋪墊2層濾紙,取100粒消毒后紫花苜蓿種子放置在培養(yǎng)皿中,加入等量不同濃度的CdCl2溶液,溶液以浸濕濾紙為宜,每個(gè)濃度處理3個(gè)重復(fù)。將培養(yǎng)皿放于25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天觀察記錄種子發(fā)芽數(shù)(按胚根與種子等長/胚芽長度達(dá)到種子長的一半為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)),持續(xù)10 d后結(jié)束。在種子培養(yǎng)到第4天的時(shí)候,計(jì)算種子的發(fā)芽勢,在種子培養(yǎng)第10天完成時(shí),計(jì)算種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù),并精確測量其芽長、根長(單位cm,保留小數(shù)點(diǎn)后兩位)。共設(shè)置6個(gè)濃度梯度(5,10,20,50,100,200 mg/L)的CdCl2溶液處理紫花苜蓿種子,以無菌水處理作為對(duì)照。通過以上種子萌發(fā)指標(biāo)的比較,篩選出明顯抑制紫花苜蓿種子萌發(fā)的CdCl2溶液濃度。

1.2.2外源物質(zhì)緩解Cd脅迫下紫花苜蓿萌發(fā)情況

實(shí)驗(yàn)所用的3種外源物質(zhì)分別為水楊酸(SA)、3-吲哚乙酸(IAA)及檸檬酸(CA)。SA溶液濃度梯度設(shè)置為50,100,200,400 μmol/L;IAA濃度配制為10,25,50,100 μmol/L;CA濃度設(shè)置為1,2,4,8 mmol/L。

將紫花苜蓿種子用上述濃度的CA、IAA和SA溶液浸種4 h,浸種完成后用蒸餾水反復(fù)沖洗種子并用濾紙吸干表面水分。將種子均勻整齊地鋪在有兩層濾紙的培養(yǎng)皿里,每皿50粒種子,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。根據(jù)1.2.1試驗(yàn)結(jié)果在每個(gè)培養(yǎng)皿中加入100 mg/L CdCl2溶液。將處理好的種子放在溫度為25 ℃的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天觀察記錄種子發(fā)芽數(shù),最終統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等指標(biāo)。

1.3 發(fā)芽指標(biāo)的計(jì)算

發(fā)芽率/%=(總的發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%;

發(fā)芽勢/%=(第4天時(shí)種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))×100%;

發(fā)芽指數(shù)(Gi)=∑(Gt/Dt),

式中:Gt表示第t天的種子發(fā)芽數(shù),Dt表示對(duì)應(yīng)種子的發(fā)芽天數(shù)。

活力指數(shù)(Vi)=Gi×S=∑(Gt/Dt)×S,

式中:Gi表示發(fā)芽指數(shù),S表示紫花苜蓿幼苗芽長,單位cm(保留小數(shù)點(diǎn)后兩位)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS19軟件進(jìn)行單因素方差分析及差異顯著性檢驗(yàn),并采用Microsoft Office2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響

本研究用6個(gè)濃度梯度的CdCl2處理維多利亞紫花苜蓿,觀察其對(duì)Cd的耐受情況。由圖1可以看出,隨著CdCl2濃度的逐漸增加,紫花苜蓿種子的4個(gè)萌發(fā)指標(biāo)(發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù))均呈下降趨勢。但是這4個(gè)萌發(fā)指標(biāo)與對(duì)照組比較,呈顯著下降時(shí)的CdCl2溶液濃度并不完全相同。紫花苜蓿在CdCl2濃度為100 mg/L時(shí)發(fā)芽率為74.67%,與對(duì)照(94.00%)相比差異顯著(p<0.05)(圖1 a);而在200 mg/L時(shí),紫花苜蓿的種子萌發(fā)才受到嚴(yán)重限制,僅有23.67%的種子萌發(fā)(圖1a)。發(fā)芽勢與發(fā)芽率具有相似的下降趨勢,但在CdCl2濃度為50 mg/L時(shí)與對(duì)照相比已經(jīng)出現(xiàn)了顯著性差異(圖1 b)。發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的變化趨勢基本一致,分別在CdCl2濃度為5 mg/L和20 mg/L時(shí)出現(xiàn)了小幅度的回升,但是發(fā)芽指數(shù)在這些CdCl2濃度下與對(duì)照均沒有明顯差異,當(dāng)CdCl2濃度上升到50 mg/L時(shí),與對(duì)照相比差異顯著(圖1 c)。就活力指數(shù)而言,在低濃度(10 mg/L)時(shí)出現(xiàn)顯著下降,而在高濃度(200 mg/L)的CdCl2溶液脅迫下活力指數(shù)幾乎為0(圖1 d)。基于以上結(jié)果可知,Cd對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)隨著濃度的增加,抑制程度也增加。綜合4個(gè)萌發(fā)指標(biāo),選定100 mg/L的CdCl2溶液作為后續(xù)的緩解Cd脅迫實(shí)驗(yàn)用濃度。

注:A為萌發(fā)率;B為發(fā)芽勢;C為發(fā)芽指數(shù);D為活力指數(shù)。圖1 鎘對(duì)紫花苜蓿種子4種萌發(fā)指標(biāo)的影響

2.2 外源物質(zhì)對(duì)Cd脅迫下紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響

由表1可以看出,100 mg/L CdCl2溶液對(duì)紫花苜蓿種子的脅迫作用在外施三種外源物質(zhì)后均出現(xiàn)了不同程度的緩解。在CA處理后,隨著浸種CA濃度的升高,Cd脅迫下的紫花苜蓿種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均有所升高,但是與單獨(dú)的Cd處理相比均無明顯差異;發(fā)芽勢和活力指數(shù)兩個(gè)萌發(fā)指標(biāo)都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,但是在施加中低濃度(<4 mmol/L)的CA后均出現(xiàn)了顯著性上升(表1)。SA浸泡紫花苜蓿種子后,Cd脅迫下發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均沒有明顯的變化;而發(fā)芽勢和活力指數(shù)在分別施加10 μmg/L和25 μmg/L的SA后顯著增加(表1)。但與CA不同的是,外源施加SA后各項(xiàng)指標(biāo)均呈上升的變化趨勢。不同濃度IAA浸種后,在100 mg/L Cd脅迫下紫花苜蓿種子各項(xiàng)萌發(fā)指標(biāo)均表現(xiàn)出先增后降的變化趨勢。這種趨勢與施加外源的CA是相同的。在4個(gè)萌發(fā)指標(biāo)中,除了發(fā)芽指數(shù)外其他3個(gè)萌發(fā)指標(biāo)(發(fā)芽率、發(fā)芽勢和活力指數(shù))均在施加外源的IAA后有所上升,且與對(duì)照相比都出現(xiàn)顯著性增加(p<0.05)(表1)。由此可知,這三種外源物質(zhì)浸種紫花苜蓿種子均有緩解Cd脅迫的作用。

表1 施加外源CA、IAA和SA對(duì)Cd脅迫紫花苜蓿種子萌發(fā)的影響

3 討 論

紫花苜蓿是一種廣泛種植的牧草,對(duì)Cd具有一定的耐受性[19]。但是,不同的紫花苜蓿品種對(duì)Cd脅迫的耐受性存在較大的差異,如阿爾岡金紫花苜蓿在低濃度(5 mg/L)Cd脅迫下種子的萌發(fā)就受到了明顯的抑制[20],與本試驗(yàn)結(jié)果顯示的維多利亞紫花苜蓿在較高濃度(100 mg/L)Cd脅迫下種子4個(gè)萌發(fā)指標(biāo)產(chǎn)生了明顯下降,存在較大的差異。為深入研究施加外源物質(zhì)對(duì)Cd脅迫的緩解作用,本研究采用了100 mg/L的CdCl2溶液作為脅迫濃度開展試驗(yàn)。種子萌發(fā)是植物感應(yīng)外界環(huán)境的初始階段,是植物生活史的一個(gè)重要組成部分。在遭受重金屬脅迫時(shí),其種子萌發(fā)指標(biāo):發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化。本試驗(yàn)采用三種外源物質(zhì)(IAA,CA和SA)處理紫花苜蓿種子后,這4個(gè)萌發(fā)指標(biāo)反應(yīng)的敏感性不同。發(fā)芽率只有在紫花苜蓿種子施加外源IAA時(shí)對(duì)Cd脅迫才有緩解作用,CA和SA即使在高濃度時(shí)對(duì)發(fā)芽率的緩解效果也不明顯(表1)。而發(fā)芽勢是最敏感的一個(gè)萌發(fā)指標(biāo),在三種外源物質(zhì)浸種后都表現(xiàn)出了顯著上升,其中施加IAA和CA后都達(dá)到了無Cd脅迫時(shí)的水平(91%),而施加SA后紫花苜蓿種子的發(fā)芽勢盡管一直處于上升的趨勢,但是在本試驗(yàn)所用的濃度下最高達(dá)到了88%(表1),不及無Cd脅迫時(shí)的水平。發(fā)芽指數(shù)是最不敏感的一個(gè)萌發(fā)指標(biāo),不管是外源物質(zhì)的種類還是濃度的高低均沒有影響這個(gè)指標(biāo)?；盍χ笜?biāo)與發(fā)芽勢相似,對(duì)三種外源物質(zhì)的施加非常敏感,除低濃度的SA(10 μmg/L)外,其他濃度的SA、CA和IAA都對(duì)Cd脅迫下的紫花苜蓿種子脅迫作用有顯著的緩解效果。因此,這些分析表明本實(shí)驗(yàn)中發(fā)芽指數(shù)不適用于作為指示外源物質(zhì)緩解Cd毒害作用的一個(gè)生理指標(biāo)。

施用外源物質(zhì)能夠有效地控制Cd污染對(duì)農(nóng)作物的毒害作用。其中,這些外源物質(zhì)種類比較多,主要包括致酸性外源物質(zhì)、土壤改良劑、稀土元素和微生物等[21]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)施加三種致酸性外源物質(zhì)(CA、IAA和SA)對(duì)紫花苜蓿種子的Cd毒害都有明顯的緩解效果。前期研究表明CA、IAA和SA能夠緩解多種植物的Cd毒害作用。如,外施SA能夠顯著緩解Cd對(duì)小報(bào)春和孔雀草幼苗的毒害作用[22-23]。同樣地,在栝樓葉片上噴施IAA溶液或者在用CA處理綿毛水蘇、披堿草、小白菜、龍葵、棉花等都能緩解Cd脅迫的影響[16-17,24-25]。這些外源物質(zhì)基本上都是通過調(diào)節(jié)植物的抗氧化系統(tǒng)和光合系統(tǒng)來增強(qiáng)植物的抗性或者是通過抑制Cd在植物體內(nèi)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)等方式來緩解Cd的毒害作用[22]。本試驗(yàn)中這三種外源物質(zhì)對(duì)維多利亞紫花苜蓿品種受到Cd毒害的緩解機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

綜上所述,Cd脅迫對(duì)維多利亞紫花苜蓿的種子萌發(fā)產(chǎn)生明顯的抑制作用,尤其是在濃度100 mg/L以上時(shí)4個(gè)萌發(fā)指標(biāo)(萌發(fā)率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù))均顯著下降。為減輕Cd脅迫作用,利用三種外源物質(zhì)(CA、SA和IAA)處理100 mg/L CdCl2脅迫維多利亞種子,發(fā)現(xiàn)這三種外源物質(zhì)均能產(chǎn)生有效的緩解作用。其中發(fā)芽指數(shù)在這三個(gè)外源物質(zhì)處理后均無明顯變化。因此,在本試驗(yàn)中發(fā)芽指數(shù)不適合作為檢測Cd毒害緩解效果的一種生理指標(biāo)。