徐聰玲,鐘世歡,張思奇,黃 南,楊天明,王 輝
1 浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司,浙江杭州 310009
2 贊宇科技集團(tuán)股份有限公司,浙江杭州 310009
關(guān)鍵字:酵母β-葡聚糖;離子色譜儀;乳制品;葡萄糖
酵母β-葡聚糖具有增強(qiáng)動(dòng)物免疫力、抗腫瘤、抗感染、降低膽固醇、促進(jìn)傷口愈合等功能,2010年5月20號(hào),被原衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品,可添加到乳制品、功能飲料、焙烤制品、糖果等食品中;2012年使用范圍再次擴(kuò)大至較大嬰兒配方乳粉。此外,酵母β-葡聚糖還具有脂肪樣口感,可作為低卡路里食品添加劑,在色拉調(diào)料、奶酪類似物等冷凍甜點(diǎn)中作為脂肪替代物使用,具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值,國(guó)內(nèi)已有乳品企業(yè)將其作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑添加在產(chǎn)品中。但國(guó)內(nèi)目前沒有酵母β-葡聚糖在乳制品中定量檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),因此,本文利用酵母β-葡聚糖是一種無味無臭不溶于水的多糖,且不溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑,可與蛋白、甘露聚糖或幾丁質(zhì)等物質(zhì)結(jié)合[1]的特性建立了乳制品中酵母β-葡聚糖的檢測(cè)方法。
Thermo ICS 3000離子色譜儀,賽默飛世爾科技有限公司;3K15高速離心機(jī),Sigma公司;AR223CN電子天平,奧豪斯(常州)儀器有限公司。
葡萄糖(C6H12O6)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%),壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司;酵母β-葡聚糖(C6H12O6)n原料(純度≥80%),江蘇佰耀生物科技有限公司;鹽酸(分析純)、亞鐵氰化鉀(分析純)、乙酸鋅(分析純)、氫氧化鈉(分析純),永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司;50%氫氧化鈉溶液(w/w),上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;鈉型前處理小柱[填料為Na型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂(Na)];色譜柱(DionexCarboPac PA10 4mm×250 mm)、色譜柱(DionexCarboPac PA1 4mm×250 mm)、色譜柱(DionexCarboPac PA2003mm×250 mm),賽默飛世爾科技有限公司。
沉淀蛋白:稱取1~5 g(精確到0.0001 g)乳粉樣品于離心管中,加入20 mL 60 ℃左右的水充分溶解,加入1 mL亞鐵氰化鉀溶液,再加入1 mL乙酸鋅溶液,渦旋混勻,高速離心2 min(6 000 r/min以上),棄掉上清液,得到沉淀。
水洗:向沉淀中加15 mL 60 ℃左右的水,渦旋至完全溶解,高速離心,棄掉上清液(反復(fù)用水清洗離心,至最后1 遍上清液中不含干擾物質(zhì))。
酸水解:向沉淀中加入10 mL 1 mol/L鹽酸溶液,121 ℃水解1 h,冷卻至室溫后用5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0~7.0,稀釋定容至50 mL,用濾紙過濾,取濾液過鈉柱后,用0.22 μm濾膜過濾上機(jī);酵母β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品或原料須與樣品同時(shí)酸水解,以便測(cè)得葡聚糖水解率。
空白試驗(yàn):除不加試樣外,其余處理同上。
(1)葡萄糖儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg(精確至0.1 mg),用水溶解稀釋后定容至10 mL。
(2)葡萄糖中間液:吸取葡萄糖儲(chǔ)備液1 mL,用水溶解稀釋后定容至10 mL。
(3)工作液:準(zhǔn)確吸取適量葡萄糖中間液,用水溶解稀釋后定容至濃度為1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL的系列工作液。
(4)亞鐵氰化鉀溶液:稱取15.0 g亞鐵氰化鉀,用水溶解稀釋后定容至100 mL。
(5)乙酸鋅溶液:稱取30.0 g乙酸鋅,用水溶解稀釋后定容至100 mL。
(6)氫氧化鈉溶液(5 mol/L):稱取20.0 g氫氧化鈉,用水溶解稀釋后定容至100 mL。
色譜條件:流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:2 μL;柱溫:35 ℃。流動(dòng)相:15 mmol/L氫氧化鈉溶液[50%氫氧化鈉溶液(w/w)配制];等度洗脫。
檢測(cè)器:脈沖安培檢測(cè)器,Au工作電極,AgCl參比電極。
檢測(cè)池溫度:30 ℃。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出對(duì)應(yīng)的樣品濃度C,由公式①計(jì)算出樣品中被測(cè)物的含量:
其中X:樣品中酵母β-葡聚糖含量,單位為mg/100 g;C:由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)得樣品中葡萄糖濃度,單位為μg/mL;V:樣品的最終定容體積,單位為mL;f:稀釋倍數(shù);m:稱樣量,單位為g;100:100 g樣品中被測(cè)物含量;1 000:μg與mg之間轉(zhuǎn)換系數(shù);F:酵母β-葡聚糖水解校正因子,F(xiàn)=1/葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品水解率 。
其中0.9:葡萄糖轉(zhuǎn)換為葡聚糖的系數(shù);C1:酵母β-葡聚糖原料水解定容液上機(jī)測(cè)得的葡萄糖含量(g/mL);V1:酵母β-葡聚糖原料水解后定容體積,單位為mL;W1:酵母β-葡聚糖質(zhì)量,單位為g。
本試驗(yàn)考察了用于酵母β-葡聚糖檢測(cè)的DionexCarboPac PA10 4×250 mm、DionexCarboPac PA14×250 mm和DionexCarboPac PA200 3×250 mm三種色譜柱上的最佳分離條件,試驗(yàn)結(jié)果表明,DionexCarboPac PA200 3×250 mm色譜柱上葡萄糖出峰時(shí)間太早。改用DionexCarboPac PA14×250 mm后,樣品中葡萄糖的分離度不理想;而DionexCarboPac PA10 4×250 mm色譜柱在出峰時(shí)間及分離度都能滿足檢測(cè)要求。因此,試驗(yàn)選擇DionexCarboPac PA10 4×250 mm色譜柱。
2.2.1 水洗次數(shù)確定
本試驗(yàn)的研究對(duì)象是乳制品,乳制品中含有乳糖,且乳糖充分水解產(chǎn)物為葡萄糖和半乳糖,而酵母β-葡聚糖不溶于水,因此前處理通過沉淀劑得到粗沉淀后,用去離子水反復(fù)清洗,直至無干擾。再用1 mol/L鹽酸121 ℃高壓水解60 min,調(diào)節(jié)pH值稀釋定容后,過鈉柱,去除多余的金屬離子。在酸水解、儀器條件一致的情況下,干擾物隨著水洗次數(shù)增多而慢慢減少,直至水洗7 次后趨近為0。結(jié)果如圖1所示,確定水洗次數(shù)不少于7 次。
圖1 水洗次數(shù)對(duì)干擾物含量的影響
2.2.2 沉淀劑選擇
根據(jù)表1試驗(yàn)結(jié)果,最后選擇亞鐵氰化鉀溶液、乙酸鋅溶液沉淀蛋白。
表1 3 種沉淀劑對(duì)樣品沉淀效果及檢測(cè)結(jié)果的影響
配制5水平的工作溶液,在選定的色譜條件下,以目標(biāo)物峰面積為縱坐標(biāo)、以目標(biāo)物的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程,結(jié)果如表2所示。在1 μg/mL,2 μg/mL,5 μg/mL,10 μg/mL,20 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.99911。
表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線線性方程及相關(guān)系數(shù)
對(duì)某品牌乳粉、純牛奶及濃奶進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),加入3 個(gè)不同濃度的酵母β-葡聚糖,每個(gè)濃度平行測(cè)定6 次,回收率結(jié)果見表3。酵母β-葡聚糖的平均回收率分別為81.5%~94.9%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.80%~4.71%,本方法的準(zhǔn)確度均滿足試驗(yàn)分析要求。
表3 酵母β-葡聚糖平均加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)
已采用本方法對(duì)現(xiàn)有樣品檢測(cè)108 批次,檢測(cè)結(jié)果滿意(表4)。
表4 某品牌幼兒配方乳粉、液奶及濃奶中酵母β-葡聚糖的檢測(cè)結(jié)果
標(biāo)準(zhǔn)品及樣品圖譜見圖2、圖3。
圖2 標(biāo)準(zhǔn)品圖譜
圖3 樣品圖譜
本文通過優(yōu)化前處理?xiàng)l件及離子色譜條件,建立了乳制品中酵母β-葡聚糖的檢測(cè)方法。根據(jù)酵母β-葡聚糖的特性,用沉淀劑沉淀蛋白,再用熱水反復(fù)沖洗沉淀,將基質(zhì)中水溶性雜質(zhì)除掉,然后用一元酸在高溫高壓下將沉淀中目標(biāo)物水解成葡萄糖,再用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值后,定容。由于處理過程中用到的沉淀劑含有金屬離子,對(duì)檢測(cè)器及色譜柱都有影響。雖然氫氧化鈉溶液沉淀一部分鐵離子,但并不完全,因此,樣液需要過鈉柱,減少金屬離子對(duì)儀器及色譜柱的損壞,再經(jīng)離子色譜柱-脈沖安培檢測(cè)器測(cè)定葡萄糖的含量,通過換算系數(shù)折算得到酵母β-葡聚糖的含量。
該方法準(zhǔn)確可靠,結(jié)果重現(xiàn)性良好,回收率高,實(shí)用價(jià)值高,適用于乳制品中酵母β-葡聚糖的檢測(cè)。