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        超高溫滅菌乳中脂肪球粒徑快速檢測研究

        2023-08-08 01:36:52馮立玲胥文玲羅軍昆王清華白曉玲
        中國乳業(yè) 2023年7期

        馮立玲,胥文玲,羅軍昆,王清華,白曉玲

        蒙牛乳業(yè)(灤南)有限責(zé)任公司,河北唐山 063500

        0 引言

        超高溫滅菌乳的保質(zhì)期時(shí)間較長,在儲(chǔ)存過程會(huì)存在多種質(zhì)量缺陷,如脂肪上浮、結(jié)塊、酸包、脹包等問題。其中脂肪上浮現(xiàn)象一直是影響長貨架期超高溫滅菌乳等乳制品質(zhì)量的首要問題。不同程度的脂肪上浮現(xiàn)象均影響產(chǎn)品的外觀及品質(zhì),嚴(yán)重時(shí)在包裝頂部可形成幾毫米厚的脂肪層,給消費(fèi)者食用時(shí)帶來不愉悅的感受和體驗(yàn)。降低或減少脂肪上浮現(xiàn)象,成為乳品企業(yè)改善產(chǎn)品品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)。

        牛奶中的脂肪以小液滴形式存在,稱為乳脂肪球[1]。牛奶中的脂肪球由于粒度大小不等、密度小、質(zhì)量輕而浮在牛奶表面形成一層奶油層,使牛奶產(chǎn)生分層現(xiàn)象[2],因此需要進(jìn)行均質(zhì)化處理。均質(zhì)化處理給牛奶帶來許多優(yōu)點(diǎn),如脂肪球變小,不形成奶油層;顏色更白、口感更佳;降低脂肪氧化敏感性,具有更強(qiáng)穩(wěn)定性和更長保質(zhì)期[3~5],成為了現(xiàn)代乳制品生產(chǎn)中不可或缺的工藝[6]。

        為監(jiān)控均質(zhì)化效果,對均質(zhì)化過程中牛奶脂肪球粒度的測定十分必要。激光粒度法作為一種快速、準(zhǔn)確的粒度測試方法已被應(yīng)用,但激光粒度分析儀較貴,檢測成本較高,一般乳品企業(yè)無法承擔(dān)[7]。為促進(jìn)生產(chǎn)過程均質(zhì)效果改善,同時(shí)提升產(chǎn)品穩(wěn)定性,需研發(fā)一種低成本、高效率、快速檢測脂肪球粒徑大小的方法。本文通過試驗(yàn)論述脂肪球粒徑檢測方法的研發(fā)過程,對比不同染色劑染色脂肪球的現(xiàn)象差異,從而確定出最優(yōu)方案。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        蘇丹Ⅲ,福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司;甲基紅、次甲基藍(lán)、鉻黑T、溴甲酚綠、甲基橙、95%濃度乙醇、草酸銨,福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司;結(jié)晶紫、番紅,北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

        ME2002E/02電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;RX50顯微鏡,寧波舜宇儀器有限公司;玻璃燒杯;載玻片;蓋玻片;滴管;鑷子。

        1.2 染色劑選擇

        蘇丹Ⅲ是一種常用的脂肪類染液,遇脂肪會(huì)變?yōu)殚冱S色。甲基橙是分析化學(xué)中常用酸堿指示劑,在中性介質(zhì)中以磺酸鈉鹽形式存在而呈現(xiàn)黃色,超高溫滅菌乳通常為中性樣品,可制備甲基橙指示劑用于該試驗(yàn)。另外,甲基紅指示劑、次甲基藍(lán)指示劑、鉻黑T指示劑、溴甲酚綠指示劑、結(jié)晶紫指示劑、番紅指示劑均為實(shí)驗(yàn)室日常檢測常用指示劑,本文引入這些指示劑用來進(jìn)行試驗(yàn),對比染色效果。

        1.3 試劑配制

        蘇丹Ⅲ指示劑:稱取0.25 g蘇丹Ⅲ粉末于錐形瓶中,加入95%濃度酒精50 mL,充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆?,過濾后備用。

        甲基紅指示劑:稱取0.1 g甲基紅,用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

        次甲基藍(lán)指示劑:稱取0.1 g亞甲基藍(lán),用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

        鉻黑T指示劑:稱取0.5 g鉻黑T,用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

        溴甲酚綠指示劑:稱取0.1 g溴甲酚綠,用95%乙醇溶解并定容至100 mL。

        甲基橙指示劑:稱取0.1 g甲基橙,溶于70 ℃水中,冷卻,稀釋至100 mL。

        結(jié)晶紫指示劑:稱取0.1 g甲基紅,用20 mL 95%乙醇溶解;稱取草酸銨0.8 g,用80 mL實(shí)驗(yàn)用水溶解;使用前將上述兩種溶液混合過濾后備用。

        番紅指示劑:稱取2.5 g甲基紅,用95%乙醇溶解并定容至100 mL。使用前取10 mL已配制的溶液,加入90 mL實(shí)驗(yàn)用水混勻后備用。

        1.4 染色方法

        待測樣品與染色劑混勻后直接檢測,無需其他處理。另外,為降低試驗(yàn)操作過程中使用酒精燈存在的安全風(fēng)險(xiǎn),減少常規(guī)制片過程使用酒精燈烘干的操作步驟,借鑒生物檢驗(yàn)花生中的脂肪實(shí)驗(yàn)操作步驟[8]中染色制片方法。除蘇丹Ⅲ染色法外,本文通過使用蓋玻片,驗(yàn)證液體樣品不烘干也能實(shí)現(xiàn)固定的目的。

        1.4.1 蘇丹Ⅲ染色法

        參考《牛奶脂肪球觀測方法》[9],具體操作步驟如下。

        (1)制片:取若干滴牛奶置于載玻片上,用鑷子固定玻片一端置于酒精燈火焰上方,直至牛奶滴烘干。

        (2)染色:在烘干后的牛奶滴上滴加蘇丹Ⅲ指示劑,靜置染色1~2 min,然后用鑷子夾住載玻片一端置于酒精燈火焰上方,直至蘇丹Ⅲ指示劑烘干。

        (3)觀察:將載玻片置于顯微鏡下,選取放大倍數(shù)為10 倍的物鏡,在100 倍(10×10)條件下,觀察染色后牛奶滴中的脂肪球。

        1.4.2 甲基橙染色法

        (1)制片染色:取1 滴已混合均勻的牛奶樣品置于載玻片上,在滴加牛奶樣品的位置滴加1 滴甲基橙指示劑,再將一片蓋玻片用鑷子輕輕覆蓋在上面。

        (2)分析觀察:將步驟(1)制備好的樣品置于顯微鏡下,在100 倍(10×10)條件下觀察。可直接用目鏡,也可用顯微鏡軟件進(jìn)行觀察。

        (3)結(jié)果判定 :將載玻片置于顯微鏡下,選取放大倍數(shù)為10 倍的物鏡,在100 倍(10×10)條件下,觀察染色后牛奶滴中的脂肪球,也可以利用顯微鏡操作軟件,通過軟件參數(shù)設(shè)置,更直接、更清晰觀察脂肪球形態(tài),還可測量脂肪球粒徑大小。

        1.4.3 其他染色劑法

        將結(jié)晶紫、番紅、甲基紅、溴甲酚綠、次甲基藍(lán)、鉻黑T指示劑,依據(jù)1.4.2步驟操作。

        1.5 結(jié)果判定

        鏡檢觀察:未經(jīng)均質(zhì)處理或均質(zhì)效果差的樣品,脂肪球大小不均勻,外形不規(guī)則,形態(tài)較大。經(jīng)均質(zhì)處理后的樣品,脂肪球?yàn)榇笮【鶆虻那蛐晤w粒,形態(tài)較小。

        本文試驗(yàn)要求鏡檢觀察的結(jié)果為脂肪球外形清晰可見,粒徑大小可通過測量確定具體數(shù)值。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 試驗(yàn)結(jié)果

        2.1.1 不同染色劑對比

        針對試驗(yàn)使用的8 種染色劑,在操作便捷性、觀察難易性、染色均勻程度及背景清晰程度等方面進(jìn)行比較(表1)。甲基橙染色法較其他方法優(yōu)勢更明顯。

        表1 不同染色方法操作對比

        2.1.2 染色劑與樣品的適宜性

        抽取超高溫滅菌乳和調(diào)制乳各10 批,分別用8種染色劑進(jìn)行樣品適宜性驗(yàn)證(表2)。

        表2 不同染色方法樣品適宜性對比

        適宜性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn):染色劑與樣品充分融合,染色均勻,鏡檢觀察時(shí)無背景雜質(zhì)干擾。

        除甲基橙外,其他染色劑與樣品混合的過程中均存在不能充分融合的現(xiàn)象,鏡檢時(shí)視野下背景干擾影響觀察效果,故甲基橙染色法較其他方法優(yōu)勢更明顯。

        2.1.3 不同染色劑染色圖片

        用顯微鏡觀察8 種不同染色劑對同一超高溫滅菌乳進(jìn)行脂肪球染色,各種染色劑染色效果存在差異,其中甲基橙染色效果最好,背景最清晰,染色后的脂肪球更易觀察;相比而言,其他染色劑染色效果較差,染色后的脂肪球不易觀察(圖1)。

        圖1 不同染色劑染色圖片

        2.2 分析方法評價(jià)

        2.2.1 蘇丹Ⅲ染色法

        蘇丹Ⅲ染色法為已有參考文獻(xiàn)可查詢的一種脂肪球檢測方法,在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)存在4 處缺陷,具體如下。

        (1)試劑配制:蘇丹Ⅲ染液配制過程存在溶解不充分現(xiàn)象,需過濾操作,步驟繁瑣。

        (2)制片:由于需觀測樣品為液體,具有流動(dòng)性,依據(jù)染色操作要求,為便于觀察,該方法對液體樣品通過烘干操作進(jìn)行固定。執(zhí)行該步驟需使用酒精燈,由于牛奶營養(yǎng)物質(zhì)豐富,經(jīng)烘干操作后,部分有機(jī)物由于烘烤溫度過高或時(shí)間過長容易糊化,染色后背景雜質(zhì)較多,導(dǎo)致脂肪球不易觀察,干擾實(shí)驗(yàn)人員操作,因此烘干環(huán)節(jié)需優(yōu)化或取消。另外,酒精燈存在火災(zāi)風(fēng)險(xiǎn)。

        (3)烘干:酒精純度越高,燃燒越充分,燃點(diǎn)越旺盛。該方法使用濃度為95%乙醇配制染色液,染色后烘干操作,載玻片經(jīng)過酒精燈火焰時(shí),極易引起燃燒,危險(xiǎn)性較大。

        (4)染色:該步驟需靜置后再次使用酒精燈烘干,耗時(shí)較長。

        2.2.2 甲基橙染色法

        該方法操作簡便、快捷高效,具體優(yōu)勢如下。

        (1)取1 滴混勻后的樣品即可滿足實(shí)驗(yàn)要求,不需烘干操作,立即滴加染色液,可實(shí)現(xiàn)染色均勻目的。

        (2)染色后無需靜置,增加蓋玻片使用。蓋玻片的作用:可使被觀察物形成薄膜,易透光,便于觀察;可使標(biāo)本相對固定;便于利用毛細(xì)現(xiàn)象,使染色液形成梯度,脂肪球染色更充分;避免標(biāo)本受污染。

        2.2.3 其他染色劑法

        結(jié)晶紫、番紅、甲基紅、溴甲酚綠、次甲基藍(lán)、鉻黑T指示劑滴加至牛奶樣品后,指示劑和牛奶樣品都不能有效融合,產(chǎn)生肉眼可見顆粒物質(zhì),鏡檢時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)染色效果差,背景干擾雜質(zhì)多,影響觀察效果。

        3 結(jié)論與討論

        為降低超高溫滅菌乳貨架期內(nèi)脂肪上浮現(xiàn)象,在牛奶均質(zhì)化及產(chǎn)品穩(wěn)定性研究過程中,對脂肪球粒徑進(jìn)行監(jiān)控十分必要。在注重產(chǎn)品質(zhì)量同時(shí),考慮檢測效率成本等因素,乳品企業(yè)尤其需高效率、低成本、快速檢測脂肪球粒徑的方法。

        本文對實(shí)驗(yàn)室日常使用指示劑進(jìn)行設(shè)計(jì),在超高溫滅菌乳中開展脂肪球檢測試驗(yàn)對比,最終確定甲基橙染色法為最優(yōu)方法。傳統(tǒng)顯微鏡直接觀察方式,只能獲得脂肪球大小的直觀表象,不能了解具體粒徑大小。甲基橙染色法引入顯微鏡操作軟件,通過軟件參數(shù)設(shè)置,不但可以更直接更清晰觀察到脂肪球的形態(tài),還可對脂肪球粒徑大小進(jìn)行測量。同時(shí),所觀察過的圖片可通過軟件存儲(chǔ),便于后期查閱。該方法快速高效,檢測成本低,簡便易行,操作更安全,可為均質(zhì)化過程提供有效監(jiān)控?cái)?shù)據(jù),能滿足乳品企業(yè)對脂肪球粒徑進(jìn)行快速檢測目的。

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