王超麗，吳 潔，任靜靜，萬 姣，楊銘偉

1 石河子獸醫(yī)協(xié)會，新疆石河子 832000

2 第八師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆石河子 832000

3 石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000

0 引言

牛支原體（Mycoplasma Bovis）是引起犢牛肺炎、關節(jié)炎和成年牛乳房炎的主要病原體之一。1961年，牛支原體被鑒定為致乳腺炎的病原體，1976年首次被描述為引起呼吸道疾病的病因[1]，此后在不同國家與地區(qū)相繼暴發(fā)與流行，給世界養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。目前已證實，牛支原體除導致牛肺炎、乳腺炎外，還可導致關節(jié)炎、角膜結膜炎、耳炎、生殖道炎、流產(chǎn)與不孕等多種疾病[2，3]。牛支原體多數(shù)由于存在與其他病原體的混合感染，對多種抗生素表現(xiàn)耐藥性，導致抗生素的治療效果產(chǎn)生偏差[4]，因此應用疫苗進行免疫預防便成為控制牛支原體病的主要措施。但目前除美國外，幾乎無商品化疫苗應用于牛支原體病的預防，還沒有文獻報道牛支原體病可以使用疫苗進行預防控制[5]。

1 試驗材料

1.1 試驗菌株及試驗動物

牛支原體新疆分離株，2010年分離自新疆石河子某牛場因肺炎死亡犢牛肺臟組織，參照文獻[6]的方法對其進行特異性PCR鑒定和oppF基因測序分析，鑒定為牛支原體；試驗用小鼠，石河子大學實驗動物中心。

1.2 主要儀器設備及試劑

ISA206雙相佐劑，法國賽比克公司；光學顯微鏡CX21，日本奧林巴斯公司；高速冷凍離心機CR22E，美國西格瑪奧德里奇公；生物安全柜BHC-Ⅱ-A/B3型，拓赫機電科技(上海)有限公司；連續(xù)波長酶標儀，美國伯樂公司；HRP標記的山羊抗小鼠IgG，史瑞克生物（上海）有限公司。

1.3 ELISA檢測相關試劑

鼠抗牛支原體陽性高免血清由免疫學實驗室制備；鼠抗牛支原體陰性血清為未免疫牛支原體疫苗，抗體檢測為陰性的健康小鼠血清。

2.5%戊二醛溶液：0.1 mol/L碳酸氫鈉（NaHCO3）溶液90 mL，25%戊二醛10 mL。

抗原包被液（0.05 mol/L Na2CO3和NaHCO3緩沖液，pH值=9.6）：Na2CO31.5 g，KCl 0.2 g，NaHCO32.9 g，ddH2O定容至1 L，調(diào)整 pH值=9.6。

PBST洗滌液（pH值=7.4）：NaCl 8.0 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KCl 0.2 g，K2HPO40.2 g，吐溫-20 0.5 mL，加ddH2O定容至1 L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

封閉液（樣品稀釋液）：PBS為介質(zhì)的2%BSA溶液，振蕩混勻，4 ℃保存。

終止液（2 mol/L硫酸）：濃硫酸22.2 mL，ddH2O177.8 mL。

PBS緩沖液（pH值=7.4）：NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，K2HPO40.2g，加ddH2O定容至1 L，調(diào)整pH值=7.4。

底物溶液：0.1 mol/L檸檬酸緩沖液5.6 mL，0.2 mol/L 磷酸氫二鈉緩沖液4.4 mL，10 mg/mL四甲基聯(lián)苯胺（用DMSO二甲基亞砜配制）100 μL，0.75%H2O242 μL，臨用前配制。

2 方法

2.1 抗原制備

將-80 ℃凍存的牛支原體菌株移入5 mL的牛支原體專用液體擴大培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2箱中培養(yǎng)3 d，后按照體積比1∶10的比例傳代3 次，待生長穩(wěn)定后作為種子菌液。按照體積比1∶10接種新鮮培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2箱中擴大培養(yǎng)4 d，作為牛支原體抗原菌懸液。

2.2 牛支原體滅活疫苗的制備

2.2.1 疫苗配制

ISA206雙相佐劑∶抗原菌懸液= 54∶46（V/V）。佐劑使用前需經(jīng)121 ℃高壓滅菌30 min。配苗前將佐劑和抗原菌懸液預熱至（31±1）℃；在150 r/min攪拌狀態(tài)下將抗原菌懸液緩慢滴入佐劑中，滴加完畢后，置恒溫震蕩培養(yǎng)箱30 ℃ 200 r/min，循環(huán)乳化 30 min，取出后置-20 ℃10 min迅速降溫，冷卻后4 ℃保存。

2.2.2 檢測指標

無菌檢測：在無菌狀態(tài)下將乳化后的疫苗分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和鮮血瓊脂培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2箱中培養(yǎng)4～5 d，觀察有無雜菌生長。

黏度檢測：用出口內(nèi)徑為1.2 mm的1 mL刻度吸管吸取室溫下雙相疫苗，然后垂直懸空吸管使疫苗乳劑自然流出，記錄流出0.4 mL乳劑所用時間。

離心檢測：用10 mL刻度離心管吸取雙相疫苗10 mL，以3 000 r/min 離心15 min，觀察其分層情況。

劑型檢測：顯微鏡400 倍下觀察雙相疫苗的均勻度，第1滴下部成拖尾云霧狀或部分散為水/油/水（W/O/W）。

穩(wěn)定性試驗：疫苗分別存放于4 ℃、37 ℃、-20 ℃環(huán)境中，在第3 d、7 d、30 d、90 d、180 d、365 d觀察疫苗穩(wěn)定性。

安全性試驗：小白鼠每只腹腔注射0.2 mL，家兔每只皮下注射1 mL，觀察其精神狀態(tài)及采食狀況。

2.3 最小免疫劑量試驗

取60 只健康小鼠，按15 只/組隨機分為A、B、C、D 組，進行免疫。A、B、C、D 組通過腿部肌肉接種牛支原體滅活疫苗，注射劑量分別為：0.1 mL/只、0.2 mL/只、0.3 mL/只、0.4 mL/只。E 組為空白對照組，為5 只健康小鼠。試驗組共免疫2 次，首免10 d后以同樣劑量補充免疫1 次，二免后第14 d、21 d分別采血，分離收集血清，-20 ℃保存待檢。

2.4 免疫持續(xù)期試驗

20 只健康小鼠通過腿部肌肉接種牛支原體滅活疫苗，0.2 mL/只，共免疫2 次。另設5 只健康小鼠為空白對照組。試驗組：首免10 d后以同樣劑量補充免疫1 次，二免后第7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d分別采血，分離收集血清，-20 ℃保存待檢。

2.5 ELISA檢測血清抗體滴度

2.5.1 酶標板預處理

酶標板中加入2.5%戊二醛溶液150 μL/孔，37 ℃2～3 h，去離子水洗滌3 次，每次5 min。

2.5.2 抗原包被及封閉

用抗原包被液將上述2.1制備的抗原菌懸液稀釋至270 μg/mL后包被酶標板，100 μL孔，4 ℃包被過夜；次日棄去孔中液體，用PBST洗滌液洗板4 次，每次5 min，拍干，加入封閉液200 μL/孔，37 ℃封閉3 h。

2.5.3 加入待檢血清

棄去孔中液體，以同樣方法洗板，將待檢血清稀釋100 倍，加入封閉好的酶標板中，100 μL/孔，同時設立陰性和陽性對照孔，置于37 ℃孵育1 h。

2.5.4 加入酶標二抗

棄去孔中液體，以同樣方法洗板，加入1∶1 000倍稀釋的HRP標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白，100 μL/孔，置于37 ℃孵育1 h。

2.5.5 顯色

棄去孔中液體，用PBST洗滌液洗板4 次，每孔加入100 μL新鮮配制的底物溶液，37 ℃避光顯色15 min，取出后立即加入終止液50 μL/孔終止反應，并迅速于450 nm波長測OD值。

3 結果

3.1 疫苗最小免疫劑量

小鼠免疫牛支原體滅活疫苗后，血清中抗體滴度明顯高于未免疫組，但0.2 mL組抗體滴度最高，因此選取0.2 mL小鼠免疫牛支原體滅活疫苗的最小免疫劑量。不同免疫劑量免疫小鼠后平均抗體滴度詳見表1。

表1 疫苗免疫后第14 d、21 d平均抗體滴度

3.2 疫苗免疫后抗體消長規(guī)律測定

牛支原體滅活疫苗免疫小鼠3 周后，抗體滴度達最高峰，隨后抗體滴度開始下降，但仍保持相對穩(wěn)定，5 周后抗體滴度呈下降趨勢。牛支原體滅活疫苗免疫小鼠后平均抗體消長規(guī)律詳見表2。

表2 牛支原體滅活疫苗免疫小鼠后平均抗體滴度（OD450）消長規(guī)律表

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，藥物對支原體類疾病治療僅可使臨床癥狀減輕或消失，停藥后病情會反復，很難徹底治愈和根除，所以控制支原體病的最有效措施是免疫接種[7]。但目前尚無商品化牛支原體疫苗，牛支原體病的防控形勢較嚴峻。本研究就課題組制備的牛支原體滅活疫苗對小鼠進行免疫試驗，發(fā)現(xiàn)接種后小鼠未見異常反應，且接種部位均正常，未見化膿及紅腫現(xiàn)象，表明疫苗安全可靠。

影響疫苗免疫效果的因素眾多，在保證疫苗免疫原性的前提下，免疫劑量及次數(shù)是影響機體免疫應答反應的主要因素之一，尤以滅活疫苗最明顯。免疫劑量不足、有效抗原量過小均不能有效誘導機體產(chǎn)生免疫應答，抗體滴度不高且持續(xù)時間短暫；免疫劑量過大可誘使機體產(chǎn)生免疫麻痹現(xiàn)象或變態(tài)反應，不但起不到預期免疫效果，相反還可能會給動物機體造成損傷。本研究設4 個劑量組對小鼠進行免疫試驗，結果表明0.2 mL組產(chǎn)生的免疫反應優(yōu)于其他3 個劑量組，抗體滴度最高，免疫后14 d平均抗體滴度為0.324，免疫后21 d平均抗體滴度為0.378，可能0.1 mL組抗原量不足，不能誘導機體產(chǎn)生較好免疫應答反應，而0.3 mL與0.4 mL組可能免疫劑量過大，導致機體出現(xiàn)麻痹現(xiàn)象；選取0.2 mL作為最佳免疫劑量免疫小鼠，免疫后進行抗體水平檢測，結果表明試驗組與對照組差異顯著，試驗組在免疫后抗體水平明顯上升，且高抗體水平可持續(xù)30 d左右。試驗結果為牛支原體滅活疫苗應用提供一定的科學依據(jù)。