李穎，王佩紅，郭鳳，張婷，杜偉平，陳菊華，孫俊

1.漢中市中心醫(yī)院婦科，陜西 漢中 723000；

2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，陜西 延安 716000

在女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤是宮頸癌，雖然隨著宮頸癌篩查和疫苗接種的普及，宮頸癌的發(fā)病率逐漸下降，但每年仍有不少女性死于宮頸癌[1]。宮頸癌的治療仍局限于放化療以及手術(shù)，而且由于宮頸癌的早期癥狀并不明顯，所以大多數(shù)人確診時已是晚期[2]。人乳頭瘤病毒(HPV)可感染宮頸轉(zhuǎn)化區(qū)的基底上皮細(xì)胞，使其增殖，導(dǎo)致上皮增生或乳頭狀瘤病[3]。宮頸癌的發(fā)展與高危(HR)HPV 感染之間存在密切的關(guān)系[4]。因此，臨床迫切需要深入了解宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找新的分子靶點，以改善宮頸癌患者的早期確診。DEP 結(jié)構(gòu)域蛋白1(DEPDC1)是在許多物種中高度保守的蛋白質(zhì)[5]。它首先被報道在膀胱癌中異常上調(diào)，并在膀胱癌細(xì)胞的生長中發(fā)揮重要作用[6]。已在多種類型的癌癥中觀察到DEPDC1 表達(dá)呈異常上調(diào)，高水平的DEPDC1與癌癥進(jìn)展密切相關(guān)，包括乳腺癌、前列腺癌和膀胱癌，并且對于預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤、肝細(xì)胞癌和肺癌患者的預(yù)后具有重要價值[7]。微小RNA(miRNA)是具有17~25 個核苷酸的小的非編碼RNA，其參與腫瘤發(fā)生[8]。MiR-216a-5p 已被證實是許多癌癥的腫瘤抑制因子[9]。miR-216a-5p 可以部分抑制HCP5 對宮頸癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用[10]。本研究旨在探討DEPDC1、miR-216a-5p 在宮頸癌及宮頸癌前病變組織中的表達(dá)及其與高危型HPV感染的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年12月至2022年4月漢中市中心醫(yī)院婦科收治的94 例宮頸病變患者為研究對象，其中62例宮頸癌前病變患者的宮頸病變組織納入癌前病變組，年齡22~45歲，平均(38.50±5.44)歲；體質(zhì)量46~71 kg，平均(59.50±7.05)kg。32例宮頸癌患者的癌組織納入宮頸癌組，年齡22~46歲，平均(39.50±5.46)歲；體質(zhì)量46~73 kg，平均(61.14±7.52)kg。同期選擇因患子宮肌瘤行子宮全切患者的正常宮頸組織30例作為對照組，年齡23~48 歲，平均(39.00±5.42)歲；體質(zhì)量45~71 kg，平均(60.00±7.32)kg。三組受檢者的一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)癌前病變和宮頸癌患者均經(jīng)過手術(shù)病理確診。(2)對照組經(jīng)MRI 檢查及臨床確診為子宮肌瘤并住院行全子宮切除術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)正在接收放化療者；(2)患有其他惡性腫瘤者；(3)合并心血管疾病、腎臟、肝臟疾病者；(4)無法正常交流的精神疾病患者；(5)處于妊娠期或者哺乳期者。本研究經(jīng)漢中市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均知情并自愿簽署研究同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 qRT-PCR 檢測宮頸組織miR-216a-5p 和DEPDC1 的表達(dá)水平 使用TRIzol 試劑(賽默飛世爾科技，貨號：15596018)提取術(shù)中獲取的組織總RNA。使用HiScript?ⅡQ RT SuperMix 試劑盒(上海信裕生物科技有限公司，貨號：XYR222)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，使用通用SYBR Green iTaq(上海恪敏生物科技有限公司，貨號：1725121)進(jìn)行qRT-PCR。DEPDC1、miR-216a-5p的表達(dá)水平用2-ΔΔCt計算方法。GAPDH 和U6 分別作為基因的內(nèi)參。由廣州日博生物科技有限公司合成引物，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence of qRT-PCR

1.2.2 免疫組化檢測組織中DEPDC1 表達(dá) 采用免疫組化法進(jìn)行組織DEPDC1蛋白表達(dá)的測定，各組織樣品分別切片常規(guī)脫蠟至水，用3%H2O2室溫處理10 min 后用蒸餾水清洗4 遍，滴加封閉液室溫下孵育15 min。加入一抗，4℃孵育過夜，沖洗；加入二抗(山羊抗兔lgG)37℃30 min；DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，最后分化，封片進(jìn)行鏡檢。免疫組化檢測試劑盒貨號為EY-24704，購自上海一研生物科技有限公司。判定方法為半定量評分法，當(dāng)DEPDC1表現(xiàn)棕黃色則為陽性表達(dá)。染色指數(shù)(staining index，SI)為陽性細(xì)胞×染色強(qiáng)度比例。陽性細(xì)胞比例<25%：0 分，25%~50%：1 分，51%~75%：2 分，>75%：3 分。染色強(qiáng)度：無染色0 分，弱染色(淺黃色)：1 分，中染色(黃褐色)：2分，強(qiáng)染色(棕褐色)：3分。3名專業(yè)人員對結(jié)果進(jìn)行評分，SI≤3分為陰性，SI>3分為陽性，總分為0~9分。

1.2.3 HR-HPV檢測 采集所有患者陰道宮頸脫落細(xì)胞行陰道鏡檢查，檢測HPV-16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、-56、-58、-59、-68 等13 個HPVE6/E7 mRNA片段的高危亞型。使用Quanti Virus?HPV E6/E7 mRNA 診斷試劑盒檢測HR-HPV狀況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS25.0軟件分析本研究數(shù)據(jù)。計量資料符合正態(tài)分布，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；三組間的較采用單因素方差分析，使用SNK-q檢驗進(jìn)一步兩兩比較。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。采用Pearson 法分析癌前病變組、宮頸癌組患者宮頸組織中DEPDC1 和miR-216a-5p 表達(dá)水平的相關(guān)性；采用Spearman 法分析DEPDC1和miR-216a-5p表達(dá)水平與癌前病變組以及宮頸癌組HR-HPV 感染的相關(guān)性。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組受檢者的DEPDC1 蛋白表達(dá)水平比較 對照組、癌前病變組、宮頸癌組患者的DEPDC1陽性表達(dá)率分別為36.67% (11/30)、40.32% (25/62)、100.00%(32/32)，與對照組比較，癌前病變組、宮頸癌組患者的DEPDC1陽性表達(dá)率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。DEPDC1在宮頸組織中的表達(dá)見圖1。

圖1 DEPDC1在宮頸組織中的表達(dá)(標(biāo)尺：50 μm)Figure 1 Expression of DEPDC1 in cervical tissues(scale plate:50 μm)

2.2 三組宮頸組織中DEPDC1 和miR-216a-5p表達(dá)水平和HR-HPV 感染情況比較 與對照組比較，癌前病變組、宮頸癌組的DEPDC1 表達(dá)水平依次升高，miR-216a-5p表達(dá)水平依次降低，HPV感染率依次升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 三組宮頸組織中DEPDC1和miR-216a-5p表達(dá)水平和HR-HPV感染情況比較[，例(%)]Table 2 Expression levels of DEPDC1 and miR-216a-5p and HR-HPV infection in cervical tissues of the three groups[,n(%)]

表2 三組宮頸組織中DEPDC1和miR-216a-5p表達(dá)水平和HR-HPV感染情況比較[，例(%)]Table 2 Expression levels of DEPDC1 and miR-216a-5p and HR-HPV infection in cervical tissues of the three groups[,n(%)]

注：與對照組比較，aP<0.05；與癌前病變組比較，bP<0.05。Note:Compared with that in the control group,aP<0.05;Compared with that in precancerous lesion group,bP<0.05.

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2.3 癌前病變組、宮頸癌組miR-216a-5p 與DEPDC1 表達(dá)水平的相關(guān)性 經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，癌前病變組、宮頸癌組患者宮頸組織中miR-216a-5p與DEPDC1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.442，P<0.01)，見圖2。

圖2 DEPDC1和miR-216a-5p表達(dá)水平相關(guān)性Figure 2 Correlation between expression levels of DEPDC1 and miR-216a-5p

2.4 癌前病變組、宮頸癌組宮頸組織中DEPDC1和miR-216a-5p 的表達(dá)與HR-HPV感染的相關(guān)性 以癌前病變組、宮頸癌組所有患者DEPDC1 和miR-216a-5p 表達(dá)水平的平均值為界限，即<1.54(n=24)為低表達(dá)，≥1.54(n=70)為高表達(dá)和<0.79(n=65)為低表達(dá)，≥0.79(n=29)為高表達(dá)。經(jīng)Spearman 法分析結(jié)果顯示，宮頸組織中DEPDC1 表達(dá)水平與癌前病變組、宮頸癌組患者HR-HPV 感染呈正相關(guān)(P<0.05)，miR-216a-5p 表達(dá)水平與癌前病變組、宮頸癌組患者HR-HPV感染呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表3。

表3 宮頸組織中DEPDC1和miR-216a-5p的表達(dá)與HR-HPV感染的相關(guān)性(例)Table3 Correlation between the expression of DEPDC1 and miR-216a-5p and HR-HPV infection in cervical tissues(n)

3 討論

宮頸癌的發(fā)生與HR-HPV的持續(xù)感染密切相關(guān)[11]。在大多數(shù)HPV感染者中，免疫系統(tǒng)可以清除HPV病毒，而HPV 的持續(xù)感染發(fā)生在10%~15%的患者中，其中大約1%的HR-HPV感染最終會發(fā)展為宮頸癌[12]。

DEPDC1過度表達(dá)對幾種不同類型的癌癥具有預(yù)后評估價值，表明它具有致癌作用及其作為生物標(biāo)志物的潛力[13]。肝細(xì)胞癌中DEPDC1表達(dá)增加與患者生存率低相關(guān)，并且DEPDC1 調(diào)節(jié)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[14]。DEPDC1與E2F1相互作用并增加其轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞中E2F 信號的過度激活，從而影響癌癥進(jìn)展[15]。先前的研究表明DEPDC1可能作為乳腺癌的早期分子標(biāo)記，DEPDC1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平在乳腺癌組織中顯著增強(qiáng)，并觀察到腫瘤分期、腫瘤大小和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的逐步增加[6，16]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，癌前病變組、宮頸癌組DEPDC1 的陽性表達(dá)率顯著升高，隨著宮頸病變程度的增加，DEPDC1的水平顯著升高，宮頸病變情況也與HR-HPV 感染有關(guān)，宮頸癌組HR-HPV感染率最高，宮頸組織中DEPDC1 表達(dá)水平與癌前病變組、宮頸癌組患者HR-HPV 感染呈正相關(guān)關(guān)系，提示宮頸病變越嚴(yán)重，DEPDC1的表達(dá)水平越高，HR-HPV感染率越高，DEPDC1的表達(dá)水平與宮頸病變進(jìn)程及HR-HPV感染有關(guān)，表明DEPDC1 的高表達(dá)能夠促進(jìn)癌變作用，進(jìn)而導(dǎo)致HR-HPV 感染率升高。

miR-216a-5p 通過靶向胰腺癌中的TPT1 來抑制腫瘤發(fā)生，還可靶向TCTN1 以阻止食管鱗狀細(xì)胞癌中的細(xì)胞增殖[17]。miR-216a-5p 在胰腺癌組織和細(xì)胞中被強(qiáng)烈下調(diào)，并起到腫瘤抑制因子的作用，其下調(diào)與胰腺癌患者的不良預(yù)后和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[18]。miR-216a-5p 的過表達(dá)可能會抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并降低嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠的致瘤性和轉(zhuǎn)移[19]。miR-216a-5p通過調(diào)控乳腺癌和小細(xì)胞肺癌中的細(xì)胞凋亡家族蛋白促進(jìn)腫瘤消退[20]。本研究結(jié)果顯示，伴隨著宮頸病變程度的增加，miR-216a-5p 水平顯著降低，表明miR-216a-5p 的表達(dá)與宮頸病變程度有聯(lián)系。miR-216a-5p 表達(dá)水平與癌前病變組、宮頸癌組患者HR-HPV 感染呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示miR-216a-5p的表達(dá)水平可以作為監(jiān)測HR-HPV 感染狀況的潛在生物學(xué)指標(biāo)。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，癌前病變組以及宮頸癌組患者DEPDC1、miR-216a-5p 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示兩者共同參與宮頸病變的發(fā)生有關(guān)。

綜上所述，DEPDC1 在癌前病變以及宮頸癌患者宮頸組織中呈高表達(dá)，miR-216a-5p呈低表達(dá)，兩者負(fù)相關(guān)，且均與HR-HPV 感染有關(guān)，有望成為潛在的宮頸病變生物標(biāo)志物。由于本次研究樣本數(shù)量較少，后期仍需要大規(guī)模的數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究。