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        超聲-微波輔助提取酸漿宿萼多糖及其體外降糖活性

        2023-08-08 01:05:24李成華秦汝蘭關(guān)穎麗付艷艷薛長(zhǎng)松朱芳嬈陳建宇
        食品研究與開發(fā) 2023年14期
        關(guān)鍵詞:酸漿降糖光度

        李成華,秦汝蘭,關(guān)穎麗,付艷艷,薛長(zhǎng)松*,朱芳嬈,陳建宇

        (1.通化師范學(xué)院長(zhǎng)白山優(yōu)勢(shì)生藥資源開發(fā)與利用實(shí)驗(yàn)室,吉林 通化 134001;2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科,吉林 長(zhǎng)春 130021)

        酸漿(Physali alkekengi L.)別名紅姑娘,主要分布在吉林、內(nèi)蒙古、四川、西藏等地[1],具有清涼、消腫、利尿等功效。民間常用酸漿宿萼(果萼)代茶飲降低糖尿病患者血糖,效果非常好[2]。酸漿多糖具有多種生物活性[3],能修復(fù)糖尿病小鼠的肝臟、腎臟,增強(qiáng)糖尿病小鼠的免疫活性,有抗衰老、抑制疲勞等作用[4],還能促進(jìn)乳酸桿菌生長(zhǎng),抑制大腸桿菌生長(zhǎng),調(diào)節(jié)腸道菌群[5]。超聲-微波協(xié)同輔助提取既擁有超聲產(chǎn)生的“機(jī)械和空化效應(yīng)”,能迅速破裂植物細(xì)胞壁;又具有微波能使物料內(nèi)外同時(shí)受熱的特性。植物細(xì)胞內(nèi)的溶劑汲取微波能,溫度急速升高,能夠產(chǎn)生瞬時(shí)高壓,破碎植物細(xì)胞壁,強(qiáng)化物質(zhì)提取[6]。超聲-微波協(xié)同提取法可以明顯縮短提取時(shí)間,節(jié)省能源消耗,且提高多糖提取率[7]。王佰靈等[8]優(yōu)選超聲-微波雙輔助法提取延齡草多糖的工藝,研究表明超聲-微波雙輔助法提取工藝簡(jiǎn)單便捷,方法切實(shí)可行,延齡草多糖提取率高于單獨(dú)超聲和單獨(dú)微波提取。李湘利等[9]運(yùn)用超聲-微波協(xié)同提取雞樅菌多糖,縮短了提取時(shí)間,提升了多糖得率。

        超聲-微波協(xié)同提取酸漿宿萼多糖相關(guān)的提取工藝參數(shù)貧乏及酸漿宿萼多糖降糖活力的相關(guān)試驗(yàn)研究鮮有報(bào)道。本研究選用酸漿宿萼為試驗(yàn)原料,采用超聲-微波協(xié)同提取酸漿宿萼多糖,通過酸漿宿萼多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制能力測(cè)評(píng)其體外降糖活力,為酸漿宿萼多糖的更深入試驗(yàn)研究提供有益借鑒。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        酸漿宿萼:自采于通化縣,30 ℃低溫烘干,粉碎過60 目篩,備用。

        葡萄糖對(duì)照品(批號(hào):161171-160921):中國(guó)食品藥品檢定研究院;α-淀粉酶(≥10 000 U/g)、α-葡萄糖苷酶(≥50 U/mg)、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS)、對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside,PNPG):上海伊卡生物技術(shù)有限公司。

        XH-300PE 微波超聲波組合萃取儀:北京祥鵠科技有限公司;UV1900 紫外-可見分光光度計(jì):上海菁海儀器有限公司;Thermo Forma 酶標(biāo)儀:美國(guó)Bio-Rad公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 多糖提取

        標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:超聲輔助蒸餾水溶解葡萄糖對(duì)照品制備0.2 mg/mL 葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備液。取對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL 于10 mL 容量瓶中,加1 mL 5%苯酚溶液,5 mL 濃硫酸溶液水浴反應(yīng)20 min,再用蒸餾水定容,于波長(zhǎng)400~600 nm 間掃描,優(yōu)選492 nm 為測(cè)定波長(zhǎng)[10]。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1.10、1.30、1.50、1.70、1.90、2.10、2.30、2.50 mL 于10 mL 容量瓶,492 nm 處檢測(cè)吸光度,參比液為蒸餾水,吸光度A 對(duì)濃度C 制作方程A=0.006 7C+0.016 2,R2=0.999 7。結(jié)果表示,葡萄糖在0.022~0.050 mg/mL 具有良好線性關(guān)系。

        樣品中多糖含量測(cè)定:稱取經(jīng)干燥箱干燥后的酸漿宿萼粉末1 g,石油醚脫脂3 h,超聲-微波協(xié)同浸提2 次,浸提液5 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心20 min,得上清液,75%乙醇醇沉,復(fù)溶,二次醇沉,干燥沉淀為酸漿宿萼多糖[11]。蒸餾水超聲溶解酸漿宿萼多糖于10 mL 容量瓶中,蒸餾水溶解并定容,于優(yōu)選的測(cè)定波長(zhǎng)處測(cè)吸光度,利用回歸方程算出濃度,求出多糖提取量。

        1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        在超聲功率200 W、微波功率250 W、協(xié)同時(shí)間5 min 的條件下,考察料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)]對(duì)多糖提取量的作用;在料液比1∶20(g/mL)、微波功率250 W、協(xié)同時(shí)間5 min 的條件下,考察超聲功率50、100、150、200、250 W 對(duì)多糖提取量的作用;在料液比1∶20(g/mL)、超聲功率150 W、協(xié)同時(shí)間5 min的條件下,考察微波功率200、250、30、350、400 W 對(duì)多糖提取量的作用;在料液比1∶20(g/mL)、超聲功率150 W、微波功率300 W 的條件下,考察協(xié)同時(shí)間2、3、4、5、6 min 對(duì)多糖提取量的作用;每組均進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)。

        1.2.3 星點(diǎn)響應(yīng)面法優(yōu)選提取條件

        結(jié)合單因素試驗(yàn)獲得的試驗(yàn)結(jié)果,考察的工藝條件為料液比(A)、超聲功率(B)、微波功率(C)、協(xié)同時(shí)間(D),運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)選酸漿宿萼多糖提取的工藝條件。多糖提取量為響應(yīng)值(Y)完成隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),各工藝因素水平見表1。

        表1 工藝因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of design

        1.2.4 降糖活力檢測(cè)

        蒸餾水超聲輔助制備0.125、0.5、2、8、16 mg/mL 系列濃度的樣品溶液,0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5 mg/mL 系列濃度的阿卡波糖陽(yáng)性對(duì)照溶液。

        1.2.4.1 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力測(cè)定

        參照表2 完成相關(guān)試驗(yàn),其中加入樣品和PNPG后都要求放置在提前預(yù)熱37 ℃烘箱中15 min,最后添加碳酸鈉使得反應(yīng)終止,使用酶標(biāo)儀選取540 nm 處檢測(cè)吸光度。

        表2 抑制α-葡萄糖苷酶試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Experimental design for α-glucosidase inhibition

        R葡萄糖甘酶=[A對(duì)照-(A樣品-A空白)]/A對(duì)照×100

        式中:R葡萄糖甘酶為α-葡萄糖甘酶抑制率,%;A對(duì)照為對(duì)照組吸光度;A樣品為樣品組吸光度;A空白為空白組吸光度。

        1.2.4.2 對(duì)α-淀粉酶的抑制能力測(cè)定

        參照沈鵬等[12]的方法制備DNS 試劑。參照表3 完成相關(guān)試驗(yàn),加α-淀粉酶后放置在提前預(yù)熱的37 ℃水浴鍋中10 min,最后加入DNS 后,使用酶標(biāo)儀選取540 nm 處檢測(cè)吸光度。

        表3 抑制α-淀粉酶試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 3 Experimental design for α-amylase inhibition

        R淀粉酶=[(A對(duì)照-A空白對(duì)照)-(A樣品-A樣品對(duì)照)-(A空白-A空白對(duì)照)]/A對(duì)照×100

        式中:R淀粉酶為α-淀粉酶抑制率,%;A對(duì)照為對(duì)照組吸光度,A樣品為樣品組吸光度,A空白對(duì)照為空白對(duì)照組吸光度,A樣品對(duì)照為樣品對(duì)照組吸光度。

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        試驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)選用Design-Expert 8.0.6、SPSS13.0軟件處理分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 料液比對(duì)多糖提取量的影響

        料液比對(duì)多糖提取量的影響見圖1。

        圖1 料液比對(duì)酸漿宿萼多糖提取量的作用Fig.1 Effect of solid to liquid ratio on polysaccharides yield

        由圖1 得知,一定程度內(nèi)酸漿宿萼多糖提取量伴隨著溶劑量的增大而增加,提取溶劑量的增大拓寬了酸漿宿萼多糖和提取溶劑兩者間濃度差,更便于多糖的溶出[13-14]。料液比達(dá)到1∶30(g/mL)后總多糖提取量趨于穩(wěn)定。這可能與隨著溶液體積變大,超聲波、微波能量發(fā)揮作用于物料上相對(duì)消弱,作用于溶劑上相對(duì)增強(qiáng)有關(guān)[14]。因此選擇料液比最佳條件為1∶20(g/mL)。

        2.2 超聲功率對(duì)多糖提取量的作用

        超聲功率對(duì)多糖提取量的作用見圖2。

        圖2 超聲功率對(duì)酸漿宿萼多糖提取量的作用Fig.2 Effect of ultrasonic power on polysaccharides yield

        由圖2 得知,酸漿宿萼多糖提取量伴隨超聲功率的增大先升后降,當(dāng)功率150 W 時(shí),達(dá)到最大值,因此選擇超聲功率工藝參數(shù)為150 W。超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)能生成空化和剪切效應(yīng),更有益于酸漿宿萼細(xì)胞的破壁,超聲功率進(jìn)一步加大反而破壞糖苷鍵有關(guān)[15]。

        2.3 微波功率對(duì)多糖提取量的作用

        微波功率對(duì)多糖提取量的作用見圖3。

        圖3 微波功率對(duì)酸漿宿萼多糖提取量的作用Fig.3 Effect of microwave power on polysaccharides yield

        由圖3 得知,酸漿宿萼多糖提取量隨微波功率的增大先升后降,微波功率300 W 時(shí),達(dá)到最大值,因此選擇微波功率工藝參數(shù)為300 W。隨著溶劑溫度迅速上升,酸漿宿萼多糖提取率在功率250~300 W 時(shí)上升很快,隨后波功率更高溶劑溫度也更高,能破壞多糖結(jié)構(gòu),導(dǎo)致溶劑甚至暴沸,多糖提取量下降[16]。

        2.4 超聲-微波協(xié)同時(shí)間對(duì)多糖提取量的作用

        超聲-微波協(xié)同時(shí)間對(duì)多糖提取量的作用見圖4。

        圖4 協(xié)同時(shí)間對(duì)酸漿宿萼多糖提取量的作用Fig.4 Effect of synergistic time on polysaccharides yield

        由圖4 得知,酸漿宿萼多糖提取量隨超聲-微波協(xié)同時(shí)間的拉長(zhǎng)展示出先增后降的趨勢(shì),在協(xié)同時(shí)間4 min 時(shí)達(dá)到峰值,因此選擇協(xié)同時(shí)間工藝參數(shù)為4 min。超聲-微波協(xié)同提取溫度上升非???,提取時(shí)間越長(zhǎng)溫度越高,高溫易使多糖水解,從而致使多糖的提取量下降[17]。

        2.5 響應(yīng)面法改進(jìn)酸漿宿萼多糖提取工藝條件結(jié)果

        響應(yīng)面法所設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方案與結(jié)果見表4。

        表4 擬合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 4 Fitting design test scheme and results

        使用Design-Expert 8.0.6 軟件采用響應(yīng)面分析法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,所得回歸方程:Y=26.64-0.30A-0.16B+0.67C+0.55D-1.41AB-0.51AC-0.41AD-1.72BC-0.58BD-0.38CD-1.06A2-1.18B2-0.42C2+0.60D2,R2=0.990 5。響應(yīng)面法對(duì)酸漿多糖提取量的方差分析見表5。

        表5 方差分析表Table 5 Variance analysis of orthogonal test

        由表5 可知,模型P 值為0.000 5,表示回歸方程與實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果擬合性好,試驗(yàn)誤差在合理范圍,證實(shí)該模型可以分析與預(yù)測(cè)酸漿宿萼多糖的提取量。各因素對(duì)多糖提取量的影響順序?yàn)镃 微波功率>A 料液比>B 超聲功率>D 協(xié)同時(shí)間。

        將表4 中試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面分析,獲得的曲面圖和等高線圖能直觀的反映2 個(gè)交相提取工藝對(duì)酸漿宿萼多糖提取量的影響。遵照上述回歸方程,分析A 料液比、B 超聲功率、C 微波功率、D 協(xié)同時(shí)間4 個(gè)考察條件對(duì)多糖提取量的作用,結(jié)果見圖5。

        圖5 各因素交互作用對(duì)多糖提取影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response diagram of the interaction of various factors on the extraction of polysaccharides

        由圖5 可知,A 料液比、B 超聲功率、C 微波功率、D協(xié)同時(shí)間工藝參數(shù)間的交互作用對(duì)宿萼多糖提取量的影響。與其它考察因素比較,A 料液比和B 超聲功率、A料液比和C 微波功率、C 微波功率和B 超聲功率分別與多糖提取量呈相應(yīng)明顯的二次拋物線關(guān)系,所構(gòu)成的三維曲面圖形陡峻,且等高線圖形為橢圓,等高線較稠密,兩工藝參數(shù)間的作用對(duì)多糖提取量影響相對(duì)大[18]。

        2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

        試驗(yàn)獲得的酸漿宿萼多糖提取的最佳條件:料液比1∶16.85(g/mL)、超聲功率160 W、微波功率316 W、協(xié)同時(shí)間3.88 min,多糖提取量為27.569 5 mg/g。考慮實(shí)際操作性,提取工藝條件調(diào)整為:料液比1∶17(g/mL)、超聲功率160 W、微波功率320 W、協(xié)同時(shí)間4 min。在此優(yōu)選工藝參數(shù)下,完成3 次驗(yàn)證,獲得的酸漿宿萼多糖為(26.13±0.11)mg/g,與模型預(yù)期值形成的誤差為5.22%,證實(shí)該方程與酸漿宿萼多糖提取試驗(yàn)完成較好擬合。

        2.7 酸漿宿萼多糖降糖能力試驗(yàn)研究結(jié)果

        酸漿宿萼多糖降糖能力試驗(yàn)研究結(jié)果見表6。

        表6 酸漿宿萼多糖降糖能力結(jié)果Table 6 Hypoglycemic activity of polysaccharides

        由表6 可知,酸漿宿萼多糖與陽(yáng)性對(duì)照品對(duì)α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制結(jié)果進(jìn)行兩樣本T 檢驗(yàn),兩者降糖結(jié)果有差異,但不顯著(t=4.314、p=0.050,t=4.032、p=0.056)。抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性是醫(yī)治2 型糖尿病初期有效途逕[19-20]。酸漿宿萼多糖具有較好的降糖活性,可與醫(yī)治2 型糖尿病的慣用藥物協(xié)同使用。

        3 結(jié)論

        超聲-微波協(xié)同提取利用超聲波的空化和剪切作用乃至微波的加熱、破壁效用來提高酸漿宿萼多糖的提取量。通過回歸方程模擬相關(guān)試驗(yàn)考察試驗(yàn)因素間的函數(shù)關(guān)系來探尋各交互考察因素的最準(zhǔn)確組合以及響應(yīng)值的最理想值。本文優(yōu)化了超聲-微波協(xié)同提取酸漿宿萼多糖的工藝,超聲-微波協(xié)同提取酸漿宿萼多糖用時(shí)4 min,該提取法更加省時(shí)、高效,酸漿宿萼多糖提取量高。酸漿宿萼多糖有降糖活力,可與醫(yī)治2型糖尿病的慣用藥物協(xié)同使用。本試驗(yàn)為酸漿宿萼多糖的更深入科學(xué)研究提供參考。

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