◎ 李麗麗，周 雪，李 勁，付錦華

（營(yíng)口市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，遼寧 營(yíng)口 115003）

嘔吐毒素，天然產(chǎn)生且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是谷物赤霉病的重要指示性毒素。嘔吐毒素廣泛污染小麥、玉米等糧食作物和飼料，是污染最為普遍和嚴(yán)重的真菌毒素之一[1]。嘔吐毒素能損害機(jī)體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致人和動(dòng)物出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等中毒癥狀[2]。我國(guó)目前明確規(guī)定谷物及其制品中嘔吐毒素限量為1 000 μg / kg[3]，而嘔吐毒素也是遼寧省儲(chǔ)備糧日常監(jiān)控和出入庫(kù)必檢項(xiàng)目之一。作為儲(chǔ)備糧承檢單位，提高實(shí)驗(yàn)室真菌毒素的檢測(cè)能力、加強(qiáng)檢測(cè)過(guò)程質(zhì)量控制對(duì)保障糧食安全具有重要意義。

為進(jìn)一步提高檢驗(yàn)檢測(cè)能力，營(yíng)口市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心于2022年參加了由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫研究院組織的小麥粉中嘔吐毒素能力驗(yàn)證考核，本文以此次能力驗(yàn)證為契機(jī)，對(duì)小麥粉中嘔吐毒素含量進(jìn)行測(cè)定并對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程關(guān)鍵點(diǎn)予以總結(jié)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與耗材

Agilent-1260 高效液相色譜儀：配紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司；QUINTIX124-1CN 電子天平：德國(guó)賽多利斯公司；ST16 高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)賽默飛公司；Multi Reax 全能型振蕩器：德國(guó)海道夫公司；MING-CHE 24UV 超純水機(jī)：德國(guó)默克密理博公司；NS-10 氮吹儀：上海屹堯儀器公司；可調(diào)移液器：普蘭德公司；0.45 μm微孔濾膜：美國(guó)歐姆尼公司；玻璃纖維濾紙：英國(guó)沃特曼公司；免疫親和柱：Romer 公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品與試劑

實(shí)驗(yàn)嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：51481-10-8）：100.0 μg/mL，Romer。

聚乙二醇：天津光復(fù)研究所；甲醇：色譜純，德國(guó)默克公司；磷酸緩沖鹽溶液：由氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、超純水按一定比例配置，用鹽酸將pH值調(diào)至7.0，涉及藥品試劑均來(lái)自天津科密歐公司。

1.3 能力驗(yàn)證及質(zhì)控樣品

能力驗(yàn)證考核樣品：由鋁塑袋真空包裝含未知濃度嘔吐毒素的小麥粉樣品2 份，計(jì)劃編號(hào)ACASPT1463，樣品編碼分別為22-A255 和22-B334，每份樣品質(zhì)量約60 g，由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫研究院提供。

能力驗(yàn)證質(zhì)控樣品：由鋁塑袋真空包裝含嘔吐毒素濃度為677 μg/kg 的小麥粉樣品一份，編號(hào)QC-WM-703，樣品質(zhì)量約50 g，購(gòu)于中國(guó)檢驗(yàn)檢疫研究院。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)

本試驗(yàn)依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y(cè)定》（GB 5009.111—2016）[4]第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法并結(jié)合作業(yè)指導(dǎo)書(shū)要求進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.2 樣品提取

待測(cè)樣品充分混勻后稱取5 g 于50 mL 離心管中，依次加入1 g 聚乙二醇和25 mL 水，混勻，振蕩提取20 min。6 000 r/min 離心10 min，玻璃纖維濾紙過(guò)濾后收集濾液于50 mL 離心管中，10 000 r/min 離心5 min，待凈化。

1.4.3 樣品凈化

免疫親和柱恢復(fù)至室溫。待免疫親和柱內(nèi)原有液體流盡后，準(zhǔn)確移取上述濾液2.0 mL 至免疫親和柱中。控制樣液以每秒1 滴的速度通過(guò)免疫親和柱，直至空氣進(jìn)入親和柱中。用5 mL PBS 緩沖鹽溶液和5 mL 水先后淋洗免疫親和柱，抽干小柱。

1.4.4 樣品洗脫

準(zhǔn)確加入2 mL 甲醇洗脫免疫親和柱，控制每秒1 滴的下滴速度，收集全部洗脫液于試管中。50 ℃下氮?dú)獯抵两?，加?.0 mL 初始流動(dòng)相，渦旋30 s 溶解殘留物，0.45 μm 濾膜過(guò)濾，收集濾液，液相色譜儀紫外檢測(cè)器測(cè)定。

1.4.5 儀器參數(shù)

色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm 粒度5 μm），美國(guó)安捷倫公司；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：50 μL；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：218 nm；流動(dòng)相：甲醇+水（20+80）。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得值和質(zhì)控樣含量，分別配制濃度為50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL、200 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，共6 點(diǎn)，液相色譜儀依次進(jìn)樣50 μL，外標(biāo)法定量。以嘔吐毒素質(zhì)量濃度為X軸、嘔吐毒素液相色譜儀測(cè)得峰面積為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，在50～500 ng/mL 范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

圖1 嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程圖

2.2 質(zhì)控及能力驗(yàn)證樣品測(cè)定

按上述試驗(yàn)條件，平行測(cè)定質(zhì)控樣中嘔吐毒素含量6 次，計(jì)算結(jié)果回收率及變異系數(shù)，以此驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，質(zhì)控樣品測(cè)定結(jié)果、回收率及變異系數(shù)均在標(biāo)準(zhǔn)要求范圍內(nèi)[5]，實(shí)驗(yàn)方法及儀器性能均可靠。

根據(jù)給定考核樣品質(zhì)量及作業(yè)指導(dǎo)書(shū)要求，按上述試驗(yàn)條件，兩份能力驗(yàn)證樣品分別平行測(cè)定5 次，計(jì)算嘔吐毒素質(zhì)量濃度，取平均值作為最終呈報(bào)結(jié)果，檢測(cè)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 嘔吐毒素質(zhì)控及能力驗(yàn)證樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)表

2.3 能力驗(yàn)證考核結(jié)果

本次能力驗(yàn)證結(jié)果考核采用Z比分?jǐn)?shù)法[6]。組織單位通過(guò)統(tǒng)計(jì)參與實(shí)驗(yàn)室反饋數(shù)據(jù)計(jì)算出考核樣品指定值及各實(shí)驗(yàn)室反饋數(shù)據(jù)的Z值。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為：Z絕對(duì)值越接近于 0, 則表示該結(jié)果符合性越好。當(dāng)∣Z∣≤2.0 為滿意結(jié)果，當(dāng)2.0 ＜∣Z∣＜3.0 為可疑結(jié)果，∣Z∣≥3.0 為不滿意（離群）結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)室2 個(gè)樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果反饋均為滿意結(jié)果，數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 嘔吐毒素能力驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果及評(píng)價(jià)表

2.4 關(guān)鍵點(diǎn)分析

2.4.1 作業(yè)指導(dǎo)書(shū)

實(shí)驗(yàn)人員收到能力驗(yàn)證考核樣后，應(yīng)第一時(shí)間對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行查驗(yàn)，仔細(xì)閱讀附帶作業(yè)指導(dǎo)書(shū)，按照指導(dǎo)書(shū)要求進(jìn)行操作。收到后如無(wú)法立刻開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，應(yīng)按照指導(dǎo)書(shū)要求進(jìn)行存放，避免待測(cè)目標(biāo)物降解、失效，影響檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)前要對(duì)樣品進(jìn)行充分混勻，避免由樣品不均造成結(jié)果重現(xiàn)性差。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線優(yōu)化

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，粗略計(jì)算能力驗(yàn)證考核樣品濃度。考慮加標(biāo)及質(zhì)控樣濃度的前提下，盡量圍繞樣品的測(cè)定值設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)，且盡量使其濃度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的中段，同時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍不可太寬，避免過(guò)低和過(guò)高濃度點(diǎn)檢測(cè)數(shù)據(jù)偏離對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性的影響。

2.4.3 實(shí)驗(yàn)操作

（1）人員。本試驗(yàn)操作過(guò)程較復(fù)雜，對(duì)試驗(yàn)人員熟練程度和經(jīng)驗(yàn)要求較高。筆者在日常實(shí)驗(yàn)時(shí)曾發(fā)現(xiàn)，含嘔吐毒素樣品洗脫后若未及時(shí)氮吹，上機(jī)后樣品測(cè)定結(jié)果及回收率均明顯偏低。因此，試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)一氣呵成，各操作步驟間避免長(zhǎng)時(shí)間暫停。

（2）免疫親和柱。待測(cè)液通過(guò)免疫親和柱凈化前，應(yīng)使柱內(nèi)原有液體通過(guò)全部柱體后流出且使柱體內(nèi)無(wú)氣泡，必要時(shí)可輕彈柱體加速氣泡冒出，保證后續(xù)待測(cè)目標(biāo)物通過(guò)凈化柱時(shí)被充分保留，減少損耗；使用免疫親和柱時(shí)，注意控制樣品流速，流速過(guò)快，免疫親和柱易吸附不完全，造成回收率不穩(wěn)定，流速過(guò)慢，免疫親和柱可能會(huì)吸附過(guò)多雜質(zhì)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（3）氮吹。試驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格監(jiān)控氮吹溫度和速度，樣品被吹至近干后立即拿出并復(fù)溶上機(jī)檢測(cè)，過(guò)高、過(guò)快、過(guò)度氮吹，都會(huì)加大待測(cè)目標(biāo)物損耗，影響結(jié)果準(zhǔn)確度；為防止交叉污染，應(yīng)提前清洗氮吹針外壁，使用后，需對(duì)氮吹針再次進(jìn)行清洗。

（4）針孔濾膜。當(dāng)前市場(chǎng)中微孔濾膜品牌眾多，不同品牌微孔濾膜材質(zhì)、過(guò)濾原理、使用對(duì)象大不相同。GB 5009.111—2016 標(biāo)準(zhǔn)中采用0.45 水相微孔濾膜，最終定容溶劑為20%甲醇水溶液，但部分品牌生產(chǎn)的水相微孔濾膜只適用于過(guò)濾純水溶劑，過(guò)濾含有機(jī)相溶劑時(shí)會(huì)造成濾膜溶膜而無(wú)法達(dá)到過(guò)濾要求。故實(shí)驗(yàn)人員在使用前應(yīng)注意其濾膜材質(zhì)與樣品最終定容溶劑是否相適用，確認(rèn)濾膜無(wú)吸附和溶解現(xiàn)象后，方可使用。

3 結(jié)語(yǔ)

本次實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)2 份小麥粉能力驗(yàn)證考核樣品進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)熟悉標(biāo)準(zhǔn)、準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)耗材、預(yù)實(shí)驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線優(yōu)化、質(zhì)控樣比對(duì)測(cè)定、能力驗(yàn)證樣品測(cè)定等步驟，得到測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)，最終順利通過(guò)能力驗(yàn)證考核。

通過(guò)參與本次能力驗(yàn)證考核，能較好地處理實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遇到的問(wèn)題并進(jìn)行歸納總結(jié)，提升檢測(cè)操作能力與水平，強(qiáng)化檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量控制，使實(shí)驗(yàn)室在嘔吐毒素檢測(cè)能力方面邁上新臺(tái)階。