◎ 蘇 芳，段志成

（1.近海流域環(huán)境測(cè)控治理福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福清 350300；2. 福建技術(shù)師范學(xué)院， 福建 福清 350300）

目前，全球范圍內(nèi)存在能源緊缺問題，各國(guó)都在積極研究和開發(fā)新能源。生物燃料（生物乙醇和生物柴油）作為可再生的新型能源，是解決能源問題的一條重要途徑。目前，幾乎所有的生物乙醇是通過陸地糧食作物發(fā)酵產(chǎn)生，但世界上糖物質(zhì)和谷物量是有限的，并且乙醇生產(chǎn)的原料成本相對(duì)昂貴。同時(shí)，將這些作物用于生產(chǎn)乙醇，勢(shì)必會(huì)與人類食品需求發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，其可能導(dǎo)致谷物和糖的價(jià)格上漲至較高水平，從而影響民生[1]。此外，種植這些作物需要大量的耕地，而耕地面積是有限的，這就導(dǎo)致其生產(chǎn)規(guī)模的不可持續(xù)[2]。全球海洋面積占地球表面積的71%，有豐富的海藻資源，每年單位面積內(nèi)的生物質(zhì)產(chǎn)量遠(yuǎn)高于陸地生物質(zhì)[3]。不僅如此，海藻不僅可節(jié)約淡水資源、不占耕地、不需要噴灑農(nóng)藥和施加化肥，還可以轉(zhuǎn)化溫室氣體CO2，是解決生物乙醇發(fā)展瓶頸的重要途徑[4]。對(duì)于利用藻類多糖進(jìn)行生物乙醇生產(chǎn)來(lái)說，酵母的發(fā)酵能力是關(guān)鍵。紫菜中含有大量的紫菜多糖，一般酵母難以降解利用。本文以紫菜多糖為底物進(jìn)行高產(chǎn)乙醇菌株的篩選鑒定，并對(duì)其發(fā)酵性能進(jìn)行研究，旨在為將來(lái)以紫菜為原料進(jìn)行乙醇工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤（福建技術(shù)師范學(xué)院五馬山校區(qū)篤思公園內(nèi)菜地）；酒曲（購(gòu)自哈爾濱正中醇酒曲廠）；腐爛紫菜、腐爛獼猴桃、腐爛桑椹；紫菜多糖購(gòu)自植提橋(西安)大健康產(chǎn)業(yè)咨詢有限公司。

富集培養(yǎng)基：一水合葡萄糖50 g/L、半乳糖50 g/L、酵母浸膏2 g/L、細(xì)菌學(xué)蛋白胨10 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、七水合硫酸鎂0.2 g/L，調(diào)節(jié)pH 為7.2（滅菌后加入無(wú)水乙醇10 g/L）。

篩選培養(yǎng)基：紫菜多糖粉30 g/L、酵母浸膏2 g/L、細(xì)菌學(xué)蛋白胨10 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、七水合硫酸鎂0.2 g/L、瓊脂粉15 g/L，調(diào)節(jié) pH 至 7.2（滅菌后加入無(wú)水乙醇10 g/L）。

活化培養(yǎng)基：紫菜多糖粉30 g/L、酵母浸膏2 g/L、細(xì)菌學(xué)蛋白胨10 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、七水合硫酸鎂0.2 g/L，調(diào)節(jié) pH 至 7.2（滅菌后加入無(wú)水乙醇10 g/L）。

發(fā)酵培養(yǎng)基：紫菜多糖粉70 g/L、豆粕粉8 g/L。

PDA 培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基39 g/L。

麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基130 g/L。

產(chǎn)子囊孢子斜面培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基3 g/L、一水合葡萄糖10 g/L、酵母浸膏3 g/L、細(xì)菌學(xué)蛋白胨5 g/L、瓊脂粉2 g/L。

氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：YNB 培養(yǎng)基68 g/L，使用前稀釋 10 倍。

碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：一水合葡萄糖20 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、氯化鈉1 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、氯化鈣0.1 g/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫菜多糖發(fā)酵菌株篩選

取10 g 分離試樣置于內(nèi)含90 mL 富集培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，在水浴恒溫振蕩器上120 rmp，37 ℃富集24 h。

取富集培養(yǎng)基培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行10 倍梯度稀釋（ 10-2、10-3、10-4），隨后將3 個(gè)稀釋后的溶液涂布于篩選培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)直至長(zhǎng)出明顯菌落。各樣品按照各稀釋梯度設(shè)置 3 組平行。

從上述平板中挑選出典型菌落進(jìn)行四區(qū)劃線分離、純化。由于能利用紫菜多糖發(fā)酵高產(chǎn)乙醇的菌株會(huì)消耗篩選培養(yǎng)基平板中的紫菜多糖，菌株周圍會(huì)產(chǎn)生透明圈，因此需要觀察透明圈的大小，篩選出透明圈較大的菌落，重復(fù)上述四區(qū)劃線純化3 次。

1.2.2 紫菜多糖發(fā)酵菌的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將篩選所得的菌株分別活化后接入裝有100 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，在120 rpm、37 ℃條件下，厭氧發(fā)酵96 h。將發(fā)酵液11 000 rpm 離心10 min 后移取上清液1 mL 至50 mL 容量瓶中定容將其稀釋。隨后，采用重鉻酸鉀-比色法測(cè)量乙醇含量，選出高產(chǎn)乙醇得率最高的菌株。

1.2.3 乙醇濃度的測(cè)定

乙醇濃度的測(cè)定采用重鉻酸鉀-比色法[4]。以 5%乙醇標(biāo)準(zhǔn)液作參比，在600 nm 的波長(zhǎng)下，測(cè)定不同乙醇濃度的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程，再根據(jù)回歸方程得到5 mL 稀釋樣品中的乙醇含量，再換算成發(fā)酵上清液中的乙醇含量。

1.2.4 糖度的測(cè)定

DNS（3,5-二硝基水楊酸）法[5]。

1.2.5 菌株常規(guī)鑒定

常規(guī)鑒定內(nèi)容主要包括形態(tài)學(xué)特征、生理特征和生理生化特征。這些常規(guī)分類鑒定指標(biāo)的鑒定方法，需根據(jù)國(guó)際微生物酵母分類中所描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[6-8]。

1.2.6 生理生化特征

同化碳源試驗(yàn)：在氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別加入適量半乳糖、赤蘚糖醇、棉子糖、可溶性淀粉、蔗糖、木糖、麥芽糖、纖維二糖、甘露醇、海藻糖、阿拉伯糖、檸檬酸、核糖、肌醇、鼠李糖作為碳源，使其濃度為50 mmol/L，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，分裝到試管中。以僅含有氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基的試管作為菌株不生長(zhǎng)的空白對(duì)照，隨后在各試管中接入1 環(huán)活化后實(shí)驗(yàn)菌株，在37 ℃條件下培養(yǎng)，在第1 周和第2 周觀察。觀察前，將菌液充分混勻，試管中出現(xiàn)渾濁計(jì)為“+”，澄清計(jì)為“-”。

發(fā)酵糖類試驗(yàn)：在氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別加入適量葡萄糖、半乳糖、蔗糖、棉子糖、麥芽糖、核糖，使其濃度為50 mmol/L。0.22 μm 濾膜過濾后，分裝到試管中，加入杜氏發(fā)酵罐后，各試管中接入1 環(huán)活化后實(shí)驗(yàn)菌株，在37 ℃條件下培養(yǎng)，每天觀察有無(wú)氣泡產(chǎn)生，有氣泡計(jì)為“+”，無(wú)氣泡計(jì)為“-”。

同化氮源試驗(yàn)：在碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別加入硝酸鉀、硫酸銨、賴氨酸、亞硝酸鈉作為氮源，使其濃度達(dá)到50 mmol/L，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，分裝到試管中。以僅含有碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基的試管作為菌株不生長(zhǎng)的空白對(duì)照。隨后在各試管中接入1 環(huán)活化后實(shí)驗(yàn)菌株，在37 ℃條件下培養(yǎng)，在第1 周和第2 周觀察。觀察前將菌液充分混勻，試管中出現(xiàn)渾濁計(jì)為“+”，澄清計(jì)為“-”。

1.2.7 菌株分子生物學(xué)鑒定

篩選分離菌株分子測(cè)序由都拜特生物有限公司完成。正反測(cè)序引物分別為鑒定酵母常用引物NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’- GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）。 測(cè)序結(jié)果查詢NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，使用Blast 在線軟件進(jìn)行相似性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

以紫菜多糖為唯一碳源進(jìn)行篩選，通過比較透明圈大小，篩得紫菜多糖分解能力較強(qiáng)的3 個(gè)菌株。將這些菌株接種進(jìn)行乙醇發(fā)酵并測(cè)定乙醇產(chǎn)量，篩選出1 株在紫菜多糖濃度70 g/L 的發(fā)酵培養(yǎng)基中乙醇產(chǎn)量達(dá)49.9 g/L 的高產(chǎn)菌株J1（酒曲來(lái)源）。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)特征觀察

由圖1 可以看出，J1 菌株的細(xì)胞顯微形態(tài)呈卵圓形，無(wú)性生殖方式為芽殖且為一端芽殖（如圖1A）；有假菌絲（如圖1B）和子囊孢子形成（如圖1C），且子囊孢子數(shù)量較少；菌落較小，質(zhì)地呈奶酪狀、粘稠、乳白色，有隆起，邊緣較為整齊，容易被接種環(huán)挑起（如圖1D）。

圖1 菌株J1 的形態(tài)特征圖

2.2.2 生理生化鑒定

菌株J1 在1 周內(nèi)能同化半乳糖、棉子糖、可溶性淀粉、蔗糖、木糖、麥芽糖、纖維二糖、甘露醇、海藻糖、阿拉伯糖、檸檬酸、核糖，不能同化赤蘚糖醇、鼠李糖和肌醇，但到第2 周結(jié)束后可同化所有供試碳源（見表1）；能發(fā)酵蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、棉子糖、核糖，但對(duì)棉子糖、半乳糖和核糖發(fā)酵能力相對(duì)較弱（見表2）；能同化硝酸鉀、硫酸銨、賴氨酸、亞硝酸（見表3）。

表1 同化碳源試驗(yàn)結(jié)果表

表2 糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表

表3 氮同化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

通過使用引物NL1 和NL4 對(duì)所篩菌株J1 進(jìn)行26S rRNA 的基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，得到大小為594 bp 的序列片段。經(jīng)Blast 在線軟件進(jìn)行相似性分析并使用MEGA7 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹后發(fā)現(xiàn)，菌株J1 以較高的置信度和釀酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae Y_1 聚于內(nèi)群的同一分支上，同源相似度99.65%（如圖2 所示）。說明J1 與釀酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae Y_1具有較近的親緣關(guān)系，屬于同一物種。因此，結(jié)合形態(tài)、生理生化特性及分子生物學(xué)測(cè)試結(jié)果，菌株J1 被鑒定為Saccharomyces cerevisiae J1。

圖2 菌株J1 的系統(tǒng)發(fā)育樹圖

3 結(jié)論

本研究通過分離和篩選，得到一株能夠分解紫菜多糖高產(chǎn)乙醇含量達(dá)49.9 g/L 的菌株J1。經(jīng)生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定，證實(shí)菌株J1 為 Saccharomyces cerevisiae J1。因此，本研究可以作為利用紫菜多糖提取乙醇酵母的依據(jù)。