劉靜

中國(guó)食品藥品檢定研究院

姚令文

中國(guó)食品藥品檢定研究院

韓瑩

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所

張靖溥

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所

聶黎行

中國(guó)食品藥品檢定研究院

何風(fēng)艷

中國(guó)食品藥品檢定研究院

戴忠

中國(guó)食品藥品檢定研究院

魏鋒*

中國(guó)食品藥品檢定研究院

馬雙成*

中國(guó)食品藥品檢定研究院

心腦靜片為《中國(guó)藥典》（2020 年版）一部收載品種，處方由黃芩、夏枯草、鉤藤、鐵絲威靈仙和朱砂等16 味藥材組成[1]，其中朱砂水飛成極細(xì)粉，黃芩、鐵絲威靈仙、淡竹葉、制天南星、龍膽、夏枯草、甘草、鉤藤8 味煎煮入藥，蓮子心、珍珠母、槐米、木香、黃柏5 味原粉入藥，人工牛黃和冰片直接入藥。心腦靜片具有平肝潛陽(yáng)，清心安神的功效。用于肝陽(yáng)上亢所致的眩暈及中風(fēng)，癥見頭暈?zāi)垦?、煩躁不寧、言語(yǔ)不清、手足不遂，也可用于高血壓肝陽(yáng)上亢證。通過(guò)檢索中國(guó)知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫(kù)，未見心腦靜片不良反應(yīng)報(bào)道。通過(guò)國(guó)家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心查詢國(guó)家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)，近5 年共計(jì)報(bào)告不良反應(yīng)12 例，均為一般不良反應(yīng)（頭暈、腹部不適、感覺減退、惡心等），嚴(yán)重不良反應(yīng)未見報(bào)道。心腦靜片處方中朱砂是發(fā)揮鎮(zhèn)靜安神作用的重要原料，為硫化物類礦物辰砂族辰砂，主含硫化汞（HgS）。由于朱砂有毒，因此入藥時(shí)通常采用水飛炮制入藥，以降低其毒性[1-3]。隨著公眾用藥安全意識(shí)的不斷提高，中藥的安全性風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題備受關(guān)注，特別是朱砂等本身含內(nèi)源性毒性成分的中藥。因此，對(duì)心腦靜片開展毒性相關(guān)的研究十分必要，能夠客觀評(píng)估其用藥安全性風(fēng)險(xiǎn)。

近年來(lái)，斑馬魚成為備受關(guān)注與重視的一種新型模式動(dòng)物。斑馬魚除與人類、小鼠具有較高的基因同源性，對(duì)藥物的反應(yīng)與人類臨床反應(yīng)相似外，其早期胚胎透明，便于在光學(xué)顯微鏡下直接觀察。因此，斑馬魚模式動(dòng)物不但具有體外試驗(yàn)高效、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)，還兼具體內(nèi)試驗(yàn)可預(yù)測(cè)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。目前，斑馬魚模式動(dòng)物在藥物篩選、毒理研究、疾病模型和作用機(jī)制等方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，尤其在化學(xué)藥品安全性與有效性研究方面應(yīng)用較多[4-6]。中藥成分復(fù)雜多樣，屬于多成分多靶點(diǎn)藥物體系，近年來(lái)已有諸多采用斑馬魚模式動(dòng)物開展安全性和有效性相關(guān)的研究[7-11]。鑒于此，本研究基于前期心腦靜片所含總汞、可溶性總汞和二價(jià)汞測(cè)定結(jié)果，借助斑馬魚模式動(dòng)物體內(nèi)外試驗(yàn)優(yōu)勢(shì)[4-9]，以斑馬魚胚胎為觀察對(duì)象，選擇汞含量不同的心腦靜片樣品多組給藥、平行比對(duì)，通過(guò)考察對(duì)胚胎發(fā)育的影響及胚胎致畸、致死的檢測(cè)來(lái)探討比較不同樣品的毒性作用，為心腦靜片的安全性研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)與支持。

1 儀器與試藥

METTLER XS105 型電子分析天平（瑞士Mettler 公司）；Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；KQ-300DA 型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；奧林巴斯SZ61 體式顯微鏡（日本Olympus 公司）。

人工海水（反滲水配制，高級(jí)海水晶購(gòu)于天津中鹽海洋生物科學(xué)有限公司）；水為超純水。鹽酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20120215）；稀鹽酸參照《中國(guó)藥典》（2020 年版）四部規(guī)定配制[12]。心腦靜片樣品3 批（分別來(lái)自兩家生產(chǎn)企業(yè)D、K，生產(chǎn)批號(hào)分別為200301、200803、201902003，編號(hào)分別為D1、D2、K3），均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

試驗(yàn)所用斑馬魚（Danio rerio）為野生型（wild type，WT）AB 品系，養(yǎng)殖于人工海水（28.5±1℃）[13-14]。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

取心腦靜片10 片，除去包衣，研細(xì)，取約3g，精密稱定，加稀鹽酸 25ml，超聲提取30min（功率300W，頻率40kHz），過(guò)濾，濾液濃縮，加水制備約20mg/ml的儲(chǔ)備原液，-20℃保存，試驗(yàn)時(shí)分別等比例稀釋、檢測(cè)。

2.2 斑馬魚胚胎毒性評(píng)價(jià)

2.2.1 分組與給藥

試驗(yàn)分組包括WT 對(duì)照組（正常對(duì)照組）與給藥組，前者為未給藥的野生型斑馬魚胚胎，后者按不同樣品分為三組測(cè)試給藥組。

選取正常發(fā)育的受精后6h（6hpf）左右的胚胎，經(jīng)多組給藥處理[13-14]，以野生型為陰性對(duì)照進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以相同倍數(shù)稀釋供試品，即濃度分別約為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、2.0mg/ml。

2.2.2 試驗(yàn)程序

（1）選取早期胚胎[正常發(fā)育的受精后6h（6hpf）左右的胚胎]，分別暴露于不同濃度的測(cè)試液，每組30 枚胚胎，置于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下發(fā)育。

（2）每日顯微鏡下觀察、記錄，包括腦、眼、心、血流、軀干（脊索/神經(jīng)管、體節(jié)）、胚體生長(zhǎng)速度等（必要時(shí)拍照記錄）。

（3）發(fā)育至第三天（3dpf）時(shí)拍攝斑馬魚的表型（脫膜后），統(tǒng)計(jì)胚胎的畸形和死亡數(shù)或存活胚數(shù)。繼續(xù)觀察至胚胎發(fā)育到第5 天，每天記錄，試驗(yàn)結(jié)束。每種濃度測(cè)試液平行檢測(cè)至少3 次。

2.2.3 數(shù)據(jù)處理

畸形率和死亡率以3 次試驗(yàn)的平均值加標(biāo)準(zhǔn)差表示。各處理組數(shù)據(jù)均與對(duì)照組進(jìn)行比較，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 (T-test)，以X±sd 制作柱狀圖，P≤0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，采用概率單位法，計(jì)算各化合物的半數(shù)異常劑量（含致畸和致死數(shù)量）（AD50）和半數(shù)中毒劑量（TD50）。

3 結(jié)果

按照上述方法，檢測(cè)樣品對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育毒性作用，分別將斑馬魚胚胎暴露于D1、D2、K3 不同濃度供試品中，觀察胚胎發(fā)育表型。

3.1 樣品D1 對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

斑馬魚胚胎經(jīng)D1 樣品處理后的表型和統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1和圖2 所示，當(dāng)樣品濃度為0.05mg/ml 時(shí)，斑馬魚胚胎出現(xiàn)一定比例的發(fā)育滯后現(xiàn)象。濃度達(dá)0.1mg/ml，異常率達(dá)到70%，表型出現(xiàn)腦干異常、心臟畸形、色素變淺、體長(zhǎng)略短等異常，但未見明顯死亡現(xiàn)象。濃度升至0.2mg/ml 時(shí)，胚胎出現(xiàn)嚴(yán)重全身性發(fā)育畸形，死亡率超過(guò)60%。濃度達(dá)到0.3mg/ml，大多數(shù)胚胎在24 小時(shí)內(nèi)死亡，存活胚胎發(fā)育停止于器官形成早期，主要畸形包括：胚胎白化，頭和眼較小、體短而彎曲，心、血管異常，腹部膨大，血液異常，少數(shù)幼體尾尖潰爛等，畸形情況隨著濃度的增高而加重。當(dāng)樣品D1濃度達(dá)到0.5mg/ml 時(shí)，24 小時(shí)內(nèi)胚胎全部死亡。

圖1 不同樣品致斑馬魚胚胎發(fā)育的畸形表型(3 dpf)

圖2 不同樣品致斑馬魚胚胎發(fā)育異常的統(tǒng)計(jì)（3 dpf，畸形率，死亡率）

3.2 樣品D2 對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

斑馬魚胚胎經(jīng)D2 樣品處理后的表型和統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1 和圖2所示，當(dāng)樣品濃度為0.02mg/ml時(shí)胚胎出現(xiàn)輕度的發(fā)育滯后現(xiàn)象；在濃度不高于0.2mg/ml 條件下，主要異常表型為軀干彎曲、體長(zhǎng)較短、體表色素淺和滯后表型，異常率達(dá)50%，死亡率為17%。當(dāng)濃度達(dá)到0.3mg/ml 時(shí)，胚胎出現(xiàn)明顯的全身性發(fā)育畸形，死亡率接近70%，其中多數(shù)死于24 小時(shí)內(nèi)。存活胚胎發(fā)育停止于器官形成早期：胚胎白化，頭和眼較小、體短而彎曲，心血管異常、腹部膨大、血液異常，畸形情況隨著濃度的增高而加重。當(dāng)樣品D2 濃度為0.5m/ml 濃度時(shí)，胚胎24 小時(shí)內(nèi)全部死亡。

3.3 樣品K3 對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

斑馬魚胚胎經(jīng)K3 樣品處理后的表型和統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1 和圖2 所示，當(dāng)樣品濃度不高于0.1mg/ml時(shí)，胚胎出現(xiàn)輕度的發(fā)育滯后和心血管異?，F(xiàn)象，畸形率不高于50%，未見明顯死亡率。自濃度0.2mg/ml 起，死亡率明顯增長(zhǎng)，約為50%；濃度在0.3～0.5mg/ml區(qū)間，胚胎死于24 小時(shí)內(nèi)的比例由50%升至90%以上。在畸形表型方面，與上述兩種樣品的致畸表型類似，包括軀干彎曲、體短、體表色素淺、頭部和心血管畸形、血液異常、腹部膨大等，且畸形情況隨著濃度的增高而加重。

3.4 結(jié)論

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3 份供試品均出現(xiàn)濃度依賴性的胚胎死亡、胚胎發(fā)育停止和畸形，如圖1 所示；同時(shí)，3 份樣品在所測(cè)濃度范圍內(nèi)對(duì)斑馬魚早期發(fā)育具有明顯的毒性和致死作用。分別計(jì)算3 份供試品半數(shù)中毒劑量（TD50）、半數(shù)致死劑量（LD50）和半數(shù)異常劑量（AD50）見表1。

表1 心腦靜片三份供試品的TD50、LD50 和AD50 情況（mg/ml）

4 討論

上述結(jié)果表明，心腦靜片供試品具有類似的胚胎發(fā)育毒性，并顯示出急性致死效應(yīng)，且其致死濃度窗口較窄。低濃度的胚胎異常表型主要為發(fā)育滯后，停藥后表型可恢復(fù)至接近正常，其中3 份供試品致畸性排序?yàn)镈1＞D2＞K3，致死性排序?yàn)?D1≥D2＞K3，總異常率排序?yàn)镈1＞D2≥K3。

心腦靜片中的朱砂為硫化物類礦物辰砂族辰砂，主含硫化汞（HgS）。由于不同形態(tài)及價(jià)態(tài)的汞毒性差異很大，其毒性大小為甲基汞＞乙基汞＞Hg2+＞Hg＋。因此，只對(duì)汞總量進(jìn)行檢測(cè)分析不能夠全面評(píng)估與反映其潛在風(fēng)險(xiǎn)，還需要同時(shí)對(duì)其形態(tài)及價(jià)態(tài)進(jìn)行綜合分析。參照《中國(guó)藥典》（2020 年版）四部通則2322 汞、砷元素形態(tài)及價(jià)態(tài)測(cè)定法，本研究前期通過(guò)采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）和高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法（HPLC-ICP-MS）分析測(cè)定了3 份心腦靜片樣品中總汞、可溶性汞的含量以及汞的存在形態(tài)。結(jié)果顯示樣品D1、D2、K3總汞測(cè)定值分別為4.37mg/片、3.23mg/片、2.71mg/片，所含可溶性總汞含量分別為4.37μg/片、16.38μg/片和16.36μg/片，其中二價(jià)汞含量分別為0.030μg/片、0.132μg/片和0.175μg/片。表明朱砂中汞的溶出率相對(duì)較低，而可溶性汞形態(tài)價(jià)態(tài)分析僅檢出Hg2+，可能還有其他未知形態(tài)存在。樣品中總汞、可溶性總汞以及二價(jià)汞的測(cè)定結(jié)果與斑馬魚胚胎急性毒性作用排序未呈現(xiàn)一定正相關(guān)性。心腦靜片急性毒性作用整體水平與處方不含朱砂的中成藥品種舒筋定痛片基本相當(dāng)，在一定程度上也反映了本品處方中朱砂經(jīng)過(guò)水飛炮制工藝起到了減毒作用。

在進(jìn)行斑馬魚胚胎急性毒性試驗(yàn)時(shí)，研究采用的是將供試品溶解于斑馬魚飼養(yǎng)液中進(jìn)行的，試驗(yàn)半數(shù)中毒劑量（TD50）、半數(shù)致死劑量（LD50）和半數(shù)異常劑量（AD50）所反映的毒性作用強(qiáng)弱，除與成分自身毒性作用有關(guān)外，還與其體內(nèi)濃度有關(guān)，而體內(nèi)濃度則取決于其吸收能力。心腦靜片處方涉及16 味中藥，所含化學(xué)成分種類復(fù)雜多樣，對(duì)于進(jìn)入體內(nèi)影響斑馬魚胚胎發(fā)育的具體成分及各自吸收能力的研究還有待進(jìn)一步深入分析。