◎ 劉錦鶴

（沈陽市食品藥品檢驗所，遼寧 沈陽 110136）

李斯特菌屬的細菌為革蘭氏陽性小桿菌，依據(jù)其生化特性可分為8個菌種，包括單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，以下簡稱單增李斯特菌）、伊氏李斯特菌（L. ivanovii）、英諾克李斯特氏菌（L. innocua）、斯氏李斯特菌（L. seeliger）等。其中單增李斯特菌因其細胞的苯酚-水浸出物可以誘導單核細胞的生成而獲得了“單核增生細菌”這個種名[1]。單增李斯特菌感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對人和動物均具有很強的致病性，其他的李斯特菌或者只是感染動物，或者只是腐生細菌[2]。

近年來，美國和加拿大等國曾多次暴發(fā)由單增李斯特菌導致的食品安全事件。據(jù)美國疾病控制與預防中心統(tǒng)計，相比沙門氏菌0.5%、諾如病毒小于0.1%、彎曲桿菌0.1%的死亡率，由單增李斯特菌引起的食物中毒事件死亡率高達15.9%。人類感染后輕癥一般為流感樣癥狀，中重度癥狀則表現(xiàn)為胃腸炎、腦膜炎、流產(chǎn)等。孕婦、嬰兒、60歲以上老人及免疫力低下者更易感染單增李斯特菌。因此，在食品安全檢測實驗室準確檢出食品中污染的單增李斯特菌尤為重要。在國內(nèi)微生物領(lǐng)域相關(guān)標準物質(zhì)極其匱乏的情況下，本研究制備了單增李斯特菌的定量標準質(zhì)量監(jiān)控樣品，通過應用其進行實驗室內(nèi)部或?qū)嶒炇议g的質(zhì)量控制活動，以保證單增李斯特菌定量檢測結(jié)果的準確和可靠。

在特征關(guān)聯(lián)圖中，特征信息Fi是頂點的集合，Ri表示頂點之間關(guān)系的集合，＜fia,fib＞表示fia,fib兩個特征信息節(jié)點之間存在一條關(guān)系弧e，若＜fia,fib＞∈Ri則＜fib,fia＞∈Ri且 fib≠fia，謂詞p(fia,fib)定義＜fia,fib＞的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

單增李斯特菌ATCC19115、伊氏李斯特菌CICC21663、斯氏李斯特菌CICC21671、英諾克李斯特菌ATCC33090，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；TSB-YE、TSA-YE、李氏增菌肉湯LB1、LB2，糖發(fā)酵管，北京陸橋；Listeria顯色培養(yǎng)基，法國科瑪嘉；脫脂奶粉，上海生工生物；海藻糖，國藥集團；麥芽糊精，上海麥克林；乳糖，北京奧博星；GP細菌鑒定卡，梅里埃公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pilot5-8ES冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；LBI-150生化培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機，Eppendorf公司；MLS-3780壓力蒸汽滅菌器，Sanyo公司；麥氏比濁儀，Vitek 2 Compact全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)，梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.5 質(zhì)量監(jiān)控樣品特性量值的定值

將瓷珠冷凍保存的單增李斯特菌、伊氏李斯特菌、斯氏李斯特菌、英諾克李斯特菌4種菌株接種至TSB-YE液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)18～24 h，取菌液劃線接種到TSA-YE瓊脂培養(yǎng)基斜面，同時接種至李斯特菌顯色培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)18～24 h。分別隨機挑取李斯特菌顯色培養(yǎng)基上菌落進行革蘭氏染色后在顯微鏡觀察，并通過接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管、生化鑒定及溶血試驗確定4種李斯特菌菌株的純度及活力[3]。

按1.3.5中定值方法，計算單增李斯特菌平板計數(shù)方法定量檢測結(jié)果的平均值作為定值結(jié)果（表4），單增李斯特菌定值結(jié)果平均值為4 357 CFU·mL-1，相對標準偏差為9.84%。

本次質(zhì)控樣品的制備是參考前人[5-11]研究的保護劑配方，通過試驗最終選定脫脂奶粉、乳糖、海藻糖、麥芽糊精作為菌種復方冷凍干燥保護劑。保護劑材料使用前按照一定比例用生理鹽水稀釋，經(jīng)115 ℃高壓滅菌15 min。冷凍干燥機及相關(guān)使用的配件需在使用前消毒滅菌。

凍干過程主要包括預凍結(jié)、初級干燥以及二級干燥等3個階段。凍干過程中溫度持續(xù)降低和水分升華而形成的冰晶會對細胞膜造成不可逆的損傷，菌種存活率在凍干過程中會受到很大的影響。因此，凍干的過程中在菌液中加入一定配比的保護劑是有效提高菌種凍干存活率的方法[4]。

單增李斯特菌質(zhì)量監(jiān)控樣品定值結(jié)果總的不確定度由兩部分組成。第一部分是測量影響因素引起，以非統(tǒng)計分析方法評定出的A類不確定度uA，其主要來源包括吸管的不確定度、溶液稀釋的不確定度、加樣體積的不確定度等；第二部分是重復檢測引起的不確定度uB，主要是檢測過程中多種因素作用下，隨機性造成各次檢測單增李斯特菌菌數(shù)不同引起的，以計數(shù)菌量的對數(shù)值求不確定度。將兩部分不確定度合成構(gòu)成定值的合成不確定度u，擴展不確定度U=ku（k=2，置信概率95%）。

但是，有關(guān)乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的研究鮮有報道。本課題組結(jié)合固態(tài)發(fā)酵飼料的產(chǎn)業(yè)化實際情況，在科學設(shè)計試驗方案的基礎(chǔ)上系統(tǒng)地研究乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料生產(chǎn)技術(shù)，本研究主要集中在發(fā)酵的工藝參數(shù)對發(fā)酵產(chǎn)品主要營養(yǎng)指標（蛋白質(zhì)）的影響及工藝參數(shù)的優(yōu)化，為乳酸菌固態(tài)發(fā)酵仔豬配合飼料的實際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1.3.3 質(zhì)量監(jiān)控樣品均勻性檢驗

吸取1 mL樣品稀釋液分別以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL加入3個李斯特菌顯示培養(yǎng)基平板中，使用1 mL流出式分度移液管，則加樣產(chǎn)生的不確定度為

1.3.4 質(zhì)量監(jiān)控樣品穩(wěn)定性考察

質(zhì)量監(jiān)控樣品凍干后，考慮到殘留的水分在冷凍狀態(tài)下形成的冰晶可能對樣品中的活菌造成二次損傷，所以置于冷藏條件下（4 ℃）進行保存，同時對該溫度下保存的樣品進行穩(wěn)定性試驗，分別于第3天、第15天、第30天隨機抽取3份樣品進行檢測，檢測方法與均勻性相同。

（4）統(tǒng)計落入網(wǎng)格u′中數(shù)據(jù)點的數(shù)量，判斷其是否滿足 density（u′）≥ τ，若滿足則將網(wǎng)格 u′標記為稠密網(wǎng)格，考察其余稀疏網(wǎng)格單元。圖3為在二維空間中使用滑動網(wǎng)格方法進行網(wǎng)格修正。

1.3.1 菌種復活、鑒定與培養(yǎng)

從樣品中隨機選取9份樣品，平均分成3組，分別由3個人獨立完成檢測，每瓶標準物質(zhì)重復3次，以平板計數(shù)方法計數(shù)的平均值作為該批次質(zhì)量監(jiān)控樣品定值的結(jié)果。

隨機將我院2016年9月~2017年9月收治的90例肺炎患兒分為兩組,每組45例。其中對照組男28例,女17例;年齡:10個月~9歲,平均年齡:3.18±0.54歲;病程:3~8d,平均病程:4.47±0.33d。觀察組男27例,女18例;年齡:11個月~9歲,平均年齡:3.19±0.55歲;病程:3~9d,平均病程:4.46±0.35d。兩組一般資料差異無顯著性意義(P>0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)量監(jiān)控樣品的均勻性檢驗

采用單因素方差分析對單增李斯特菌質(zhì)量監(jiān)控樣品進行均勻性檢驗。從表1、表2可以看出，F(xiàn)＜自由度為（f1，f2）及給定顯著性水平α（通常α=0.05）的臨界值Fα（f1，f2），表明樣品內(nèi)和樣品間無顯著性差異，樣品是均勻的。樣品不均勻性所引起的誤差與測量誤差相比可以忽略不計，因此樣品均勻性良好。

表1 質(zhì)量監(jiān)控樣品的均勻性實驗數(shù)據(jù)表

表2 質(zhì)量監(jiān)控樣品均勻性實驗數(shù)據(jù)單因素方差分析表

2.2 質(zhì)量監(jiān)控樣品的穩(wěn)定性檢驗

將2×3份樣本結(jié)果的平均值（對數(shù)轉(zhuǎn)換后）與均勻性檢驗結(jié)果（x-=3.641 lgCFU·mL-1）比較，之間的絕對差值除以應用該質(zhì)量監(jiān)控樣品進行的質(zhì)量控制活動中得到的能力評價用穩(wěn)健標準偏差σ（σ=0.579），以比值小于0.3為原則確定樣品要求的最長保存時間。表3穩(wěn)定性檢驗的結(jié)果表明，樣品在穩(wěn)定性檢驗期間是穩(wěn)定的，達到了作為質(zhì)量監(jiān)控樣品的要求。

致力于成為中國一流的新型肥料供應商和農(nóng)化服務(wù)商，艾力農(nóng)公司與肥必施公司等多個知名企業(yè)及機構(gòu)合作，通過引進和研發(fā)等多種模式不斷為中國市場提供新型高效的肥料產(chǎn)品。深圳市艾力農(nóng)生態(tài)發(fā)展有限公司總經(jīng)理國士峰在講話中表示，艾力農(nóng)始終堅持以“科技創(chuàng)新、合作共贏、誠信高效、服務(wù)一流”為服務(wù)理念，以技術(shù)、服務(wù)與品牌打造企業(yè)發(fā)展根基。艾力農(nóng)不斷整合產(chǎn)品、專家、營銷等多種資源，致力于引進世界優(yōu)質(zhì)肥料，順應國家“減肥增效”的政策要求，進一步推動中國農(nóng)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。國士峰也表示，艾力農(nóng)將繼續(xù)與行業(yè)內(nèi)企業(yè)、經(jīng)銷商開展廣泛的合作，共同提升行業(yè)發(fā)展水平，實現(xiàn)企、商、農(nóng)各方的互利共贏。

表3 單核細胞增生李斯特菌質(zhì)量監(jiān)控樣品的穩(wěn)定性實驗數(shù)據(jù)表

2.3 質(zhì)量監(jiān)控樣品特性量值的確認

1.3.2 制備方法

通過對這些定理的證明、應用分析以及證明實施,尋求函數(shù)極限與數(shù)列極限的內(nèi)在聯(lián)系;給學生展示用數(shù)列極限處理函數(shù)極限有關(guān)問題的典型方法和技巧,特別是用數(shù)列極限證明函數(shù)極限不存在的典型方法和技巧，努力使學生對這些方法以及應用這些方法的技巧留下較深刻的印象，為學生逐步理解和掌握Heine歸并原則,并為學生嘗試應用這些原理所提供的思想和方法證明其他問題打下基礎(chǔ)。

表4 單核細胞增生李斯特菌質(zhì)量監(jiān)控樣品定值結(jié)果表

2.4 質(zhì)量監(jiān)控樣品定值結(jié)果的不確定度評定

將單增李斯特菌標準菌株制備成麥氏濁度0.5的菌液，其余3種李斯特菌標準菌株制成麥氏濁度3的菌液作為背景菌，4種菌液各取1 mL添加到保護劑（生理鹽水100 mL＋脫脂奶粉10 g＋乳糖8 g＋海藻糖5 g＋麥芽糊精5 g）中混合均勻，無菌條件下分裝至預先滅菌西林瓶中凍干。主要參數(shù)：降溫速度0.5 ℃·min-1、冷凍溫度-40 ℃、加熱溫度10 ℃、冷阱溫度-80 ℃、真空度10 bar。凍干后，對該質(zhì)控樣品均勻性和穩(wěn)定性進行評價[12]。

2.4.1 測量影響因素的不確定度uA

質(zhì)量監(jiān)控樣品稀釋所用的量器分別為1 mL和10 mL的流出式分度移液管，根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[3]規(guī)定，其容量允差分別為±0.008 mL和±0.05 mL，故連續(xù)稀釋所產(chǎn)生的相對不確定度為

從樣品中隨機選取12份樣品，在重復條件下，即在同一實驗室中由相同人員使用相同檢測方法和設(shè)備在較短時間內(nèi)檢測2×12份樣品。檢測結(jié)果數(shù)據(jù)用單因素方差分析進行定量統(tǒng)計。

2.4.2 重復檢測引起的不確定度uB

3位檢測人員分別對9份質(zhì)量監(jiān)控樣品進行檢測，每份樣品重復檢測3次，具體數(shù)值參見表4，經(jīng)計算重復檢測引起的不確定度uB＝0.045 56。

2.4.3 合成不確定度u

企業(yè)財務(wù)數(shù)據(jù)是企業(yè)的高度保密數(shù)據(jù)，只有企業(yè)的高層以及企業(yè)財務(wù)管理人員才能接觸到核心的財務(wù)數(shù)據(jù)，傳統(tǒng)的財務(wù)管理模式下，企業(yè)的財務(wù)數(shù)據(jù)多以電子或紙質(zhì)報表的形式呈現(xiàn)，這種“透明”的財務(wù)管理模式使得機密的財務(wù)數(shù)據(jù)面臨著很大的泄漏風險。在互聯(lián)網(wǎng)環(huán)境下，企業(yè)財務(wù)數(shù)據(jù)的信息化借助強大的計算機安全防護措施，如身份認證措施、計算機防火墻、用戶密碼登錄等可以有效防控接觸到機密財務(wù)數(shù)據(jù)的人員，有效隔絕非法人士對機密財務(wù)數(shù)據(jù)的獲取，充分保證企業(yè)財務(wù)管理不受到惡意的侵犯。

合成不確定度計算為

通常取包含因子k=2，則對數(shù)均值擴展不確定度U=ku=2×0.236 8=0.473 6。則該質(zhì)量監(jiān)控樣品中的單增李斯特菌的含量范圍為103.6392±0.4736CFU·mL-1。

3 結(jié)論與討論

隨著《食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）頒布實施，目前已制定了肉制品、冷凍飲品、部分乳制品中單核細胞增生李斯特菌的限量要求。由于《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》（GB 4789.30—2016）中才加入了定量檢測的方法，該項目的質(zhì)量監(jiān)控樣品在國內(nèi)尚屬空缺。模擬真實樣品，背景菌相對復雜的質(zhì)量監(jiān)控樣品對于評價實驗室檢驗檢測的能力，有針對性地開展內(nèi)外部質(zhì)量控制活動具有非常積極的作用。本次實驗制備的質(zhì)量監(jiān)控樣品具有較好的穩(wěn)定性，但總體的保護率和預期有一定的差距，可能與預凍過程中缺少對于降溫速率的有效驗證以及保護劑在凍干前的孵育時間有關(guān)。

測量不確定度是與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，用于表征合理賦予被測量值的分散性。目前隨著新版實驗室認可準則的頒布實施，開展微生物定量檢測測量不確定度評定，對客觀分析檢測數(shù)據(jù)結(jié)果具有十分重要的意義。此次檢測結(jié)果的不確定度主要是由樣本的重復檢測、樣本稀釋、加樣體積3方面產(chǎn)生的，其中重復性檢測引入的不確定度是最主要的不確定度分量?？梢妵栏窨刂撇僮鳝h(huán)境、培養(yǎng)條件以及提高操作人員的技術(shù)能力，是降低不確定度分量重要且有效的措施。

(1)血管壁是藥物傳遞到靶腫瘤組織的第一道屏障。然而，根據(jù)EPR的作用機制，大分子藥物很容易從腫瘤血管泄漏處到達腫瘤組織間質(zhì)。因此，腫瘤中的血管壁不作為高分子藥物或納米藥物的屏障； 相反，它們促進大分子藥物選擇性地傳遞到腫瘤組織，成功將大分子藥物輸送到腫瘤細胞。

本次實驗制備的質(zhì)量監(jiān)控樣品，可作食品安全監(jiān)管部門評價食品安全抽檢監(jiān)測承檢機構(gòu)實驗室檢驗能力水平之用，亦可作為實驗室自身開展內(nèi)部質(zhì)量控制活動的手段。通過開展相應質(zhì)量控制活動，有效了解自身的技術(shù)能力，達到不斷提高實驗室相應的微生物檢測能力的目的。