劉元豪 邢忠 許環(huán)順 肖平

(?？谑械谌嗣襻t(yī)院骨科,海南 海口 571100)

骨關(guān)節(jié)炎是臨床常見的一種漸進(jìn)性、退行性關(guān)節(jié)病變,其發(fā)病機(jī)制尚未闡明。目前研究發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞損傷是破壞軟骨組織的重要原因之一,炎癥與細(xì)胞凋亡等均可能造成軟骨細(xì)胞損傷。既往研究顯示植物提取物具有抗炎、抗氧化等作用,并可減輕軟骨細(xì)胞炎癥損傷,但其相關(guān)作用機(jī)制還不明確〔1～4〕。杜仲具有抗氧化、抑菌等作用,樹皮是主要用藥部位,研究表明杜仲可明顯抑制促炎細(xì)胞因子表達(dá)從而抑制氣道變應(yīng)性炎癥〔5〕。miR-127-5p在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中呈低表達(dá),上調(diào)其表達(dá)可通過靶向調(diào)控脂聯(lián)素(adipo)R1從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖及抑制炎癥反應(yīng)〔6〕。杜仲能否通過調(diào)控miR-127-5p發(fā)揮作用尚未可知。本研究探討杜仲調(diào)控miR-127-5p對(duì)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞HC-OA凋亡、增殖、細(xì)胞周期、炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 杜仲購(gòu)自亳州市億弘堂藥業(yè)有限公司;人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞HC-OA購(gòu)自北京科瑞思博生物技術(shù)有限公司;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco;白細(xì)胞介素(IL)-1β購(gòu)自美國(guó)Sigma;Lipofectamine2000、Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen;anti-miR-NC、miR-127-5p inhibitor購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR試劑購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;噻唑藍(lán)(MTT)試劑、凋亡檢測(cè)試劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;IL-6、IL-1β檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 杜仲水提物制備〔7〕:稱取杜仲100 g,研磨成粉后加入70%乙醇(8倍量),加熱回流提取后減壓濃縮后干燥備用,濃度為10 g/ml,分別稀釋為0.01、0.10、1.00 mg/ml。HC-OA細(xì)胞調(diào)整濃度為1×105個(gè)/ml,將其接種于96孔板,每孔100 μl,添加IL-1β(10 ng/ml)培養(yǎng)24 h〔8〕,標(biāo)記為IL-1β組;將常規(guī)培養(yǎng)的HC-OA細(xì)胞標(biāo)記為Con組。添加含不同濃度(0.01、0.10、1.00 mg/ml)的杜仲培養(yǎng)液與10 ng/ml IL-1β培養(yǎng)24 h,分別為IL-1β+杜仲低劑量組、IL-1β+杜仲中劑量組、IL-1β+杜仲高劑量組。miR-127-5p inhibitor、anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至HC-OA細(xì)胞后添加含1 mg/ml杜仲培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,依次為杜仲高劑量+miR-127-5p inhibitor組、杜仲高劑量+anti-miR-NC組。

1.3MTT檢測(cè)HC-OA細(xì)胞增殖 收集各組HC-OA細(xì)胞,加入20 μl MTT溶液,室溫培養(yǎng)4 h,3 000 r/min離心5 min,棄上清,加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO),5 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處吸光度值(OD),并計(jì)算增殖抑制率〔(對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%〕。

1.4細(xì)胞周期測(cè)定 收集各組HC-OA細(xì)胞,加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞(500 μl),加入預(yù)冷70%乙醇(3.5 ml),充分混勻后放入4 ℃冰箱內(nèi)過夜,3 000 r/min離心棄上清,PBS洗滌后,向細(xì)胞沉淀中加入50 μl RNaseA,37 ℃水浴30 min后加入碘化丙啶(PI)染色液450 μl,4 ℃孵育30 min后上機(jī)檢測(cè)各階段細(xì)胞比例。

1.5流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定HC-OA細(xì)胞凋亡率 向各組HC-OA細(xì)胞中添加預(yù)冷PBS,洗滌后棄上清,添加結(jié)合緩沖液500 μl重懸細(xì)胞,分別加入5 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin) Ⅴ-FITC、PI,室溫孵育10 min,上熒光激活細(xì)胞分選(FACS)Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)測(cè)定HC-OA細(xì)胞凋亡率。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測(cè)定miR-127-5p水平 Trizol法從各組HC-OA細(xì)胞中提取總RNA,檢測(cè)RNA濃度后,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)條件:42 ℃ 15 min,95 ℃ 3 min,cDNA置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。cDNA稀釋20倍后進(jìn)行qRT-PCR。應(yīng)用熒光定量PCR儀(羅氏LightCycler480)檢測(cè)miR-127-5p水平。

1.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IL-6、IL-1β水平 收集各組HC-OA細(xì)胞上清液,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒的說明檢測(cè)IL-6、IL-1β的水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1杜仲對(duì)HC-OA增殖的影響 與Con組比較,IL-1β組細(xì)胞存活率降低,G0-G1期細(xì)胞比例降低,S期細(xì)胞比例升高;與IL-1β組比較,IL-1β+杜仲中劑量組、IL-1β+杜仲高劑量組細(xì)胞增殖存活率升高,G0-G1期細(xì)胞比例升高,S期細(xì)胞比例降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且呈劑量依賴性(均P<0.05),見表1。

表1 杜仲對(duì)HC-OA存活率、細(xì)胞周期的影響

2.2杜仲對(duì)HC-OA凋亡及miR-127-5p表達(dá)的影響 與Con組比較,IL-1β組細(xì)胞凋亡率升高,miR-127-5p表達(dá)降低;與IL-1β組比較,IL-1β+杜仲中劑量組、IL-1β+杜仲高劑量組細(xì)胞凋亡率下降,miR-127-5p表達(dá)升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且呈劑量依賴性(P<0.05),見圖1、表2。

圖1 杜仲對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響

表2 杜仲對(duì)HC-OA凋亡、miR-127-5p及炎癥因子表達(dá)的影響

2.3杜仲對(duì)HC-OA中炎癥因子水平的影響 與Con組比較,IL-1β組IL-6、IL-1β水平明顯增加;與IL-1β組比較,IL-1β+杜仲中劑量組、IL-1β+杜仲高劑量組上述指標(biāo)的水平明顯降低(P<0.05),見表2。

2.4抑制miR-127-5p對(duì)杜仲作用的HC-OA增殖、凋亡的影響 與杜仲高劑量+anti-miR-NC組比較,杜仲高劑量+miR-127-5p inhibitor組細(xì)胞增殖存活率和G0-G1期細(xì)胞比例顯著降低,S期細(xì)胞比例和凋亡率顯著增高(P<0.05),見圖2、表3。

圖2 抑制miR-127-5p對(duì)杜仲作用的軟骨細(xì)胞凋亡的影響

表3 抑制miR-127-5p對(duì)杜仲作用的HC-OA抑制率、細(xì)胞周期、凋亡及炎癥因子表達(dá)的影響

2.5抑制miR-127-5p對(duì)杜仲作用的HC-OA中炎癥因子表達(dá)的影響 與杜仲高劑量+anti-miR-NC組比較,杜仲高劑量+miR-127-5p inhibitor組IL-6、IL-1β水平顯著升高(P<0.05),見表3。

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎是一種致殘率較高的疾病,臨床主要采用西藥等方法進(jìn)行治療,但西藥具有不良反應(yīng)且部分患者對(duì)藥物易產(chǎn)生耐藥性,傳統(tǒng)中藥在治療骨關(guān)節(jié)炎方面可發(fā)揮重要作用,甘草素、黃芩素、牛膝醇提物等均可影響關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡、增殖等生物學(xué)行為〔9～11〕。

杜仲具有強(qiáng)筋骨、補(bǔ)肝腎等作用,其在治療骨關(guān)節(jié)炎方面作用重大,但其調(diào)控機(jī)制仍不明確〔12～14〕。本研究提示杜仲可抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖,并可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0-G1期。本研究提示杜仲可促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡。IL-6、IL-1β屬于促炎因子,其在軟骨細(xì)胞中的水平升高可加重細(xì)胞炎癥損傷〔15,16〕。本研究提示杜仲可降低骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

circRNA.33186通過充當(dāng)miR-127-5p的海綿分子促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生〔17〕。circ_0136474、MMP-13通過與miR-127-5p競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來而抑制骨關(guān)節(jié)炎中的軟骨細(xì)胞增殖〔18〕。miR-127-5p調(diào)節(jié)骨橋蛋白的表達(dá)而介導(dǎo)人軟骨細(xì)胞增殖〔19〕。本研究提示杜仲可能通過提高miR-127-5p表達(dá)影響細(xì)胞進(jìn)展。阻礙miR-127-5p表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)杜仲對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞周期、凋亡、增殖及炎癥反應(yīng)的影響。