席婷， 姚曉光， 胡君麗

小鼠成肌細(xì)胞低氧/復(fù)氧模型的建立及驗(yàn)證*

席婷1， 姚曉光2△， 胡君麗2

［1新疆醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830001；2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院高血壓中心，新疆高血壓研究所，國(guó)家衛(wèi)生健康委高血壓診療研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室“新疆高血壓病研究實(shí)驗(yàn)室”，新疆高血壓（心腦血管）疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆 烏魯木齊 830001］

構(gòu)建體外小鼠成肌細(xì)胞間歇性低氧/復(fù)氧模型并驗(yàn)證。設(shè)定三氣培養(yǎng)箱的混合氣中1%或4% O2含量為低氧培養(yǎng)條件，二氧化碳培養(yǎng)箱中的條件為復(fù)氧條件，將小鼠成肌細(xì)胞（C2C12）分別按不同氧濃度（1%和4%）及復(fù)氧循環(huán)周期（6 h和8 h）處理，結(jié)束后觀察細(xì)胞增殖情況，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase， LDH）及分泌性蛋白質(zhì)分子——含III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白5（fibronectin type III domain containing 5， FNDC5）濃度，測(cè)定細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α）蛋白的表達(dá)水平。（1） 1%低氧濃度組較4%低氧濃度組細(xì)胞增殖慢、FNDC5含量低，培養(yǎng)液中葡萄糖濃度高、LDH活性及細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)較高（<0.05）。（2）1%低氧濃度條件下，與循環(huán)周期6 h組相比，循環(huán)周期8 h組細(xì)胞活力顯著下降（<0.05）。本研究模擬了體外小鼠成肌細(xì)胞在不同低氧/復(fù)氧條件下的損傷狀況及FNDC5的差異表達(dá)，1%低氧濃度和復(fù)氧循環(huán)周期6 h可作為較佳的體外C2C12細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒l件。

小鼠成肌細(xì)胞；間歇性低氧；含III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白5；缺氧誘導(dǎo)因子1α

阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea， OSA）是一種常見(jiàn)的睡眠呼吸障礙性疾病，可引發(fā)或加重心腦血管疾病并導(dǎo)致代謝紊亂，尤其與高血糖、胰腺β細(xì)胞凋亡、胰島素抵抗之間存在顯著關(guān)聯(lián)［1-2］。間歇低氧可導(dǎo)致胰腺組織氧化應(yīng)激狀態(tài)和胰腺β細(xì)胞凋亡，OSA與血糖異常兩者在神經(jīng)-內(nèi)分泌-代謝方面關(guān)系復(fù)雜、相互影響。骨骼肌運(yùn)動(dòng)后產(chǎn)生一種分泌性蛋白質(zhì)分子——含III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白5（fibronectin type III domain containing 5， FNDC5），裂解后釋放出一種多肽物質(zhì)鳶尾素（irisin），可作用于腦、肝、心臟、骨骼肌等，在降低血糖中起著重要的作用［3］，已有研究提示該物質(zhì)可能參與2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus， T2DM）的進(jìn)展［4］，而血清FNDC5水平也與OSA發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。曹冰等［5］研究顯示合并較不合并有OSA的T2DM患者血清Irisin水平低。目前間歇性低氧對(duì)骨骼肌相關(guān)的葡萄糖代謝中間途徑尚不完全明確，有關(guān)體外骨骼肌細(xì)胞間歇性低氧誘導(dǎo)模型仍處在探索階段。

細(xì)胞低氧-復(fù)氧模型被廣泛的用于機(jī)體缺血再灌注研究，有以下兩種造模方法，物理性造模方法的難點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)條件的控制和低氧狀態(tài)的平衡與維持；化學(xué)性造模方法的難點(diǎn)主要是造成實(shí)驗(yàn)所需低氧狀態(tài)所需化學(xué)試劑的作用劑量及作用時(shí)間的選擇。因此，模型成功的建立需要在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中針對(duì)不同細(xì)胞及不同的實(shí)驗(yàn)要求，摸索適合的造模方法。本實(shí)驗(yàn)選取肌源性祖細(xì)胞-成肌細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀察在不同程度低氧-復(fù)氧條件下，體外培養(yǎng)的小鼠成肌細(xì)胞活力、損傷情況、低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α）及FNDC5等相關(guān)指標(biāo)變化，對(duì)于后續(xù)OSA致糖尿病的發(fā)病機(jī)制研究具有參考意義。

材料和方法

1　主要材料

C2C12小鼠成肌細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2　主要試劑與儀器

胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）購(gòu)自依科賽生物公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline， PBS）粉劑購(gòu)自北京中杉金橋生物公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；小鼠FNDC5 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美生物公司；抗HIF-1α抗體購(gòu)自Abcam；蛋白預(yù)染Marker購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase， LDH）測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）及DMEM（高糖）培養(yǎng)基均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；PVDF膜（0.45 μm）購(gòu)自Millipore。ChemiScope 3000化學(xué)發(fā)光儀購(gòu)自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-Rad；三氣培養(yǎng)箱購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自上海力康儀器有限公司。

3　方法

3.1試劑配制10%血清DMEM（高糖）培養(yǎng)液：10 mL的FBS加入90 mL的DMEM（高糖）培養(yǎng)液中，添加1 mL的青-鏈霉素雙抗溶液；10% CCK-8溶液配制：按照CCK-8與完全培養(yǎng)基1∶9比例配制10% CCK-8檢測(cè)溶液。

3.2細(xì)胞培養(yǎng)（1）細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮中取出凍存的細(xì)胞，置于37 ℃水浴中快速晃動(dòng)凍存管2 min，加入到DMEM（高糖）培養(yǎng)液，離心棄上清，將細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃、飽和濕度、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（2）細(xì)胞傳代：取出細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，加入3 mL無(wú)菌PBS緩沖液反復(fù)沖洗后棄去，加入1 mL的胰酶，使胰酶溶液平鋪在細(xì)胞層面上，緩緩搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并放于37℃培養(yǎng)箱中消化1～2 min，加入1 mL的DMEM培養(yǎng)液終止胰酶的消化作用，并用吸頭反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶底將未脫落的細(xì)胞沖洗下來(lái)后離心，并用2 mL的DMEM培養(yǎng)液重懸沉淀的細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，并調(diào)整合適的細(xì)胞密度接種到培養(yǎng)瓶中，37 ℃，飽和濕度，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（3）取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，融合率達(dá)90%的C2C12細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液制備成密度為每5×104/mL個(gè)單細(xì)胞懸液，用于不同氧濃度條件下的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

3.3不同氧濃度培養(yǎng)條件下的細(xì)胞培養(yǎng)將上述C2C12細(xì)胞隨機(jī)分為5個(gè)組進(jìn)行培養(yǎng)，各組氣相培養(yǎng)環(huán)境的培養(yǎng)液、溫度及濕度同前。低氧濃度、低氧-復(fù)氧循環(huán)次數(shù)分別如下：

（1） 正常對(duì)照（control）組：常氧條件下培養(yǎng)；1%間歇低氧（intermittent hypoxia， IH） 6 h組（IH6-1%組）：即1%的O2低氧60 min，20%的O2復(fù)氧30 min，低氧和常氧交替進(jìn)行4個(gè)循環(huán)，共培養(yǎng)6 h；IH6-4%組：即4%的O2低氧60 min，20%的O2復(fù)氧30 min，低氧和常氧交替進(jìn)行4個(gè)循環(huán)，共培養(yǎng)6 h；IH8-1%組：即1%的O2低氧60 min，20%的O2復(fù)氧30 min，低氧和常氧交替進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，繼續(xù)30 min的低氧，共培養(yǎng)8 h；IH8-4%組：即4%的O2低氧60 min，20%的O2復(fù)氧30 min，低氧和常氧交替進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，繼續(xù)30 min的低氧，共培養(yǎng)8 h。

4　主要觀察指標(biāo)檢測(cè)

4.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察各組細(xì)胞處理完成后，在倒置光學(xué)相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及貼壁細(xì)胞的數(shù)量變化。

4.2CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力各組細(xì)胞處理完成后，每孔加入CCK-8溶液，常氧條件下在培養(yǎng)箱中孵育，1 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（）值。

4.3生化試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平及葡萄糖（glucose， GLU）濃度各組細(xì)胞處理完成后，收集各組細(xì)胞上清，進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)。參照LDH測(cè)定試劑盒和GLU測(cè)定試劑盒實(shí)驗(yàn)操作說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算公式：葡萄糖濃度（mmol/L）=（測(cè)定值-空白值）/（標(biāo)準(zhǔn)值-空白值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（5.5 mmol/L）；LDH濃度（U/L）=（測(cè)定值-對(duì)照值）/（標(biāo)準(zhǔn)值-空白值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.2 μmol/L）×1 000。

4.4ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中FNDC5水平采用ELISA試劑盒進(jìn)行以下試劑配制。在樣本孔中加入細(xì)胞培養(yǎng)上清液100 μL，晃動(dòng)混勻后覆板貼，37 ℃溫育2 h，棄去液體，甩干。加生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，覆板，37 ℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，每孔200 μL，甩干。每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μL，覆板，37 ℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，每孔200 μL，甩干。每孔加底物溶液后加終止溶液50 μL，終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處依序測(cè)量各孔的值。

4.5Western blot檢測(cè)細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)水平（1）將收集的細(xì)胞冷PBS漂洗，離心棄上清，加入100 μL RIPA裂解液，在玻璃勻漿器冰上充分勻漿，冰浴放置1 h后離心收集上清。（2）加入適量5×SDS-PAGE上樣緩沖液（含β-巰基乙醇），100 ℃沸水加熱處理5 min，使蛋白充分變性，離心取上清備用。（3）樣品及預(yù)染蛋白每孔上樣25 μg。（4）電泳：80 V恒壓使溴酚藍(lán)至分離膠處，恒壓100 V，90 min，溴酚藍(lán)到達(dá)較底部時(shí)，停止電泳。（5）轉(zhuǎn)膜：SDS-PAGE結(jié)束后，將PVDF膜在甲醇中浸泡10 s，蒸餾水中漂洗1 min，制備轉(zhuǎn)膜“三明治”，夾子的黑色面在下，依次是海綿—濾紙—膠—PVDF膜—濾紙—海綿—夾子的透明面，恒壓轉(zhuǎn)膜，電壓100 V，β-actin轉(zhuǎn)膜時(shí)間為60 min，HIF-1α轉(zhuǎn)膜時(shí)間為90 min。（6）轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜水洗3次，每次5 min，用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉轉(zhuǎn)印膜1 h，用TBST稀釋Ⅰ抗，4 ℃孵育過(guò)夜后加2 mL至膜上，用ChemiScope mini化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)、拍照。

5　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 25.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較采用LSD方法。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　倒置顯微鏡下各組細(xì)胞形態(tài)改變

細(xì)胞圖像通過(guò)顯微鏡（×400）攝取，正常對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)飽滿，排列緊密，多呈梭型、多角形，細(xì)胞邊緣完整清晰；間歇性缺氧組成肌細(xì)胞正常形態(tài)被破壞，生長(zhǎng)緩慢，部分細(xì)胞脫落；其中IH8-1%組形態(tài)變化更明顯，部分細(xì)胞融合成片，死細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中。見(jiàn)圖1。

Figure 1.　Morphological changes in C2C12 cells after treated with different oxygen concentrations and hypoxia-reoxygenation cycles. Observation under the microscope revealed that cells in the control group exhibited a large spherical shape with tightly arranged spindle-shaped or polygonal cells， having clearly demarcated cell edges.The normal morphology of cells in the IH groups was disrupted， with slow growth， indistinct cell boundaries， and some cell shedding. The IH8-1% group showed the most significant morphological changes， with cell swelling and cell fusion in some locations， accompanied by some suspended necrotic cells. The scale bar=20 μm.

2　細(xì)胞活力檢測(cè)及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH含量測(cè)定

與對(duì)照組相比，間歇性缺氧組細(xì)胞活力均下降，IH6-1%組、IH8-1%組細(xì)胞活力分別低于IH6-4%組、IH8-4%組，結(jié)果均有顯著差異（0.05）；LDH含量在低氧復(fù)氧4個(gè)循環(huán)（IH6）組中出現(xiàn)了輕度增加，而在低氧復(fù)氧5個(gè)循環(huán)（IH8）組中顯著增加。實(shí)驗(yàn)IH8-1%組細(xì)胞活力最低、LDH含量最高，與對(duì)照組、IH8-4%、IH6-1%、IH6-4%組相比結(jié)果均有顯著差異（0.05），見(jiàn)表1。

表1　不同分組細(xì)胞活力、LDH含量比較

△0.05control group；▲0.05IH6-1% group；▽0.05IH6-4% group；▼0.05IH8-1% group.

3　細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖和FNDC5濃度測(cè)定

在低氧復(fù)氧5個(gè)循環(huán)（IH8）組中，IH8-1%組葡萄糖濃度高于IH8-4%組；而IH8-1%組FNDC5濃度組低于IH8-4%組，結(jié)果均有顯著差異（0.05）。在低氧復(fù)氧4個(gè)循環(huán)（IH6）組中IH6-1%組葡萄糖濃度高于IH6-4%組；IH6-1%組FNDC5濃度低于IH6-4%組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），見(jiàn)表2。

表2　不同分組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中GLU、FNDC5濃度比較

△0.05control group；▲0.05IH6-1% group；▽0.05IH6-4% group；▼0.05IH8-1% group.

4　Western blot檢測(cè)細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)

成肌細(xì)胞HIF-1α蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞核中，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯增加，結(jié)果均有顯著差異（0.05）。其中IH8-1%組HIF-1α蛋白表達(dá)水平最高，與IH6-1%、IH6-4%組比較均有顯著差異（0.05），見(jiàn)圖2、表3。

Figure 2.　The protein expression of HIF-1α was detected by Western blot.

表3　不同分組的小鼠成肌細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)水平

△0.05control group；▲0.05IH6-1% group；▽0.05IH6-4% group.

討論

OSA患者低氧程度和低氧時(shí)間對(duì)于對(duì)糖尿病的發(fā)生發(fā)展均有重要作用。本研究利用小鼠成肌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，觀察了不同氧濃度和低氧復(fù)氧時(shí)間條件下C2C12細(xì)胞變化，結(jié)果顯示低氧-復(fù)氧環(huán)境中氧濃度和循環(huán)時(shí)間對(duì)C2C12細(xì)胞增殖、活力及其分泌的FNDC5濃度均有影響，進(jìn)而影響葡萄糖代謝。與人體心肌細(xì)胞濃度（2％～6％）［6］相比，骨骼肌細(xì)胞在發(fā)育中處于低氧（3.6％～4.0％）微環(huán)境［7］，但目前尚無(wú)準(zhǔn)確定義OSA事件期間動(dòng)物骨骼肌細(xì)胞氧濃度的數(shù)據(jù)。本研究選取輕度低氧1%、生理性低氧4%兩個(gè)低氧條件，該低氧條件與Martin等［8］研究模擬C2C12小鼠成肌細(xì)胞相似，持續(xù)暴露24 h觀察細(xì)胞功能受損狀況。蔡曉紅［9］等自主研發(fā)設(shè)計(jì)細(xì)胞氧艙，建立人肺腺癌細(xì)胞A549的低氧體外模型，設(shè)置低氧60 min/復(fù)氧30 min，6個(gè)循環(huán)。Wang等［10］研究建立人內(nèi)皮細(xì)胞不同間歇低氧模式的體外模型，設(shè)定不同復(fù)氧時(shí)間（0.25 min/1.75 min/5.25 min/8.25 min）及循環(huán)時(shí)間（6.32 h/9.32 h/12 h/20 h），即不同種類細(xì)胞體外研究的低氧及復(fù)氧持續(xù)時(shí)間各不相同。本研究考慮到骨骼肌細(xì)胞耐低氧能力比較強(qiáng)，培養(yǎng)箱氣相的平衡并不瞬時(shí)，氣體置換需要一定時(shí)間，為達(dá)到所需的低氧濃度，故本研究加以改進(jìn)，設(shè)置低氧/復(fù)氧時(shí)間60 min/30 min，交替6/8個(gè)循環(huán)模擬低氧模型，結(jié)果顯示低氧-復(fù)氧時(shí)間延長(zhǎng)將降低C2C12成活率。在間歇性低氧條件下，人體細(xì)胞可以將其主要代謝策略從主要的線粒體呼吸轉(zhuǎn)向糖酵解速率的增加，糖酵解的變構(gòu)調(diào)節(jié)與低氧誘導(dǎo)因子密切相關(guān)，其主要負(fù)責(zé)上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖酵解酶的轉(zhuǎn)錄［11］，有利于在低氧條件下維持能量代謝。HIF由多個(gè)亞單位組成，其中HIF-1α在低氧應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制中起著核心作用。在本實(shí)驗(yàn)中，IH6-1%組和IH8-1%組在相同的低氧濃度下，隨低復(fù)氧循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)，HIF-1α蛋白表達(dá)含量增加顯著；IH8-1%組和IH8-4%組在相同的復(fù)氧循環(huán)時(shí)間下，氧濃度較低者，HIF-1α蛋白表達(dá)含量增加更多，即供氧濃度越低，暴露時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)量越高。這與Chávez等［12］較早在持續(xù)低氧大鼠腦組織中HIF-1α的表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所不同，該研究在持續(xù)低氧（10％）的條件下，在第12 h時(shí)HIF-1α表達(dá)達(dá)到高峰，隨后含量逐漸下降，第21 h時(shí)恢復(fù)至基礎(chǔ)水平，這可能與組織對(duì)低氧的適應(yīng)性調(diào)節(jié)有關(guān)，這同時(shí)也提示間斷低氧不同于持續(xù)低氧，這種特殊的高頻率的低氧模式，低氧程度更重，對(duì)組織的損害更大。LDH通常用來(lái)衡量細(xì)胞膜損傷程度，本實(shí)驗(yàn)中IH8組LDH含量高于IH6組，且IH8-1%組顯著高于IH8-4%組，這提示低氧誘導(dǎo)成肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，可能不僅取決于低氧的程度，還取決于復(fù)氧的頻率，這與李宏杰等［13］研究結(jié)果一致。

Bostr?m等［14］最先在小鼠肌肉組織中檢測(cè)到FNDC5，在體內(nèi)經(jīng)過(guò)剪切和修飾后轉(zhuǎn)變形成肌肉因子Irisin，上調(diào)棕化相關(guān)基因和UCP-1蛋白的表達(dá)［15］，加速能量消耗，促進(jìn)骨骼肌對(duì)葡萄糖的吸收，改善糖耐量和胰島素抵抗［16］。在我們研究中觀察到IH8-1%組FNDC5表達(dá)量最低，較IH6-1、IH6-2組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這也間接證明在細(xì)胞模型基礎(chǔ)上低氧可能通過(guò)引起FNDC5下降，導(dǎo)致血糖代謝紊亂。在4組實(shí)驗(yàn)中，IH8-1%組細(xì)胞損傷嚴(yán)重，凋亡明顯，參與氧化應(yīng)激的HIF-1α蛋白表達(dá)含量最高，而在糖代謝通路中的FNDC5的表達(dá)量最低，致培養(yǎng)液中葡萄糖含量最高，但該組較IH6-1%組活力低，循環(huán)周期長(zhǎng)，IH6-1%組同樣在細(xì)胞損傷、生化指標(biāo)、FNDC5等方面與其他各組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，故認(rèn)為IH6-1%組為較佳處理組。

細(xì)胞研究作為與整體動(dòng)物研究互補(bǔ)的研究手段，既能夠模擬活體細(xì)胞一系列病理生化改變，又具有條件可控、樣本均一可比、重復(fù)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但本研究仍有不足之處：（1）細(xì)胞生長(zhǎng)在幾毫米厚的培養(yǎng)液中，溶解在培養(yǎng)液中的氧氣受氣體擴(kuò)散和自由對(duì)流等的影響，由于本實(shí)驗(yàn)條件有限，未能動(dòng)態(tài)測(cè)定培養(yǎng)箱中的氧濃度；（2）在低氧階段結(jié)束時(shí)，未測(cè)定各個(gè)觀察指標(biāo)數(shù)值?？傊?，本研究通過(guò)對(duì)低氧濃度及復(fù)氧循環(huán)時(shí)間兩個(gè)因素進(jìn)行把控，較好地模擬了體外小鼠骨骼肌細(xì)胞低氧/復(fù)氧后損傷狀況及FNDC5的差異表達(dá)，為OSA致糖代謝通路異常的研究提供良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

［1］ Xu H， Liang C， Zou J， et al. Interaction between obstructive sleep apnea and short sleep duration on insulin resistance： a large-scale study： OSA， short sleep duration and insulin resistance［J］. Respir Res， 2020， 21（1）：151.

［2］李光， 柴文戍， 康健. 間歇低氧小鼠胰腺β細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 中國(guó)病理生理雜志， 2011， 27（4）：794-797.

Li G， Chai WS， Kang J. Pancreas of intermittent hypoxia mice β experimental study on apoptosis and its mechanism［J］. Chin J Pathophysiol， 2011， 27（4）：794-797.

［3］ Huh JY， Panagiotou G， Mougios V， et al. FNDC5 and irisin in humans： I. predictors of circulating concentrations in serum and plasma and II. mRNA expression and circulating concentrations in response to weight loss and exercise［J］. Metabolism， 2012， 61（12）：1725-1738.

［4］ Moreno-Navarrete JM， Ortega F， Serrano M， et al. Irisin is expressed and produced by human muscle and adipose tissue in association with obesity and insulin resistance［J］. J Clin Endocrinol Metab， 2013， 98（4）：769-780.

［5］曹冰， 王莉， 邢鈺敏， 等. 2型糖尿病患者血清鳶尾素、攝食抑制因子-1、3-硝基酪氨酸水平與糖脂代謝和阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征的關(guān)系研究［J］. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2022， 22（20）：3887-3891.

Cao B， Wang L， Xing YM， et al. Study on the relationship between the levels of serum iris， feeding inhibitor-1， 3-nitrotyrosine， glucose and lipid metabolism and obstructive sleep apnea hypopnea syndrome in patients with type 2 diabetes［J］. Prog Mod Biomed， 2022， 22（20）：3887-3891.

［6］ Mas-Bargues C， Sanz-Ros J， Román-Domínguez A， et al. Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine［J］. Int J Mol Sci，2019， 20（5）：1195.

［7］張維華， 於麗明， 韓欣欣，等.低氧對(duì)骨骼肌成肌細(xì)胞增殖分化的影響及相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 生理科學(xué)進(jìn)展， 2019， 50（5）：326-332.

Zhang WH， Yu LM， Han XX， et al. Research progress in the effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of skeletal muscle myoblasts and related mechanisms ［J］. Prog Physiol Sci， 2019，50 （5）：326-332 .

［8］ Martin N， Aguilar-Agon K， Robinson GP， et al. Hypoxia impairs muscle function and reduces myotube size in tissue engineered skeletal muscle［J］. J Cell Biochem， 2017， 118（9）：2599-2605.

［9］蔡曉紅，洪芳芳，陳利亞， 等.一種改良的間歇性低氧細(xì)胞模型方法［J］. 中國(guó)病理生理雜志，2016，32（1）：187-192.

Cai XH， Hong FF， Chen LY， et al. An improved method for intermittent hypoxia cell model ［J］. Chin J Pathophysiol， 2016，32 （1）： 187-192.

［10］ Wang J， Li X，Endothelial dysfunction in a cell culture model exposed to various intermittent hypoxia modes［J］. High Alt Med Biol， 2020， 21（4）：388-395.

［11］ Semenza G L. HIF-1 mediates metabolic responses to intratumoral hypoxia and oncogenic mutations［J］. J Clin Invest， 2013， 123（9）：3664-3671.

［12］ Chávez J C， Agani F， Pichiule P， et al. Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha in the brain of rats during chronic hypoxia［J］. J Appl Physiol， 2000， 89（5）：1937-1942.

［13］ 李宏杰， 章廣玲， 張連元， 等. 一種用于研究骨骼肌缺血/再灌注損傷的細(xì)胞模型［J］. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志， 2005， 21（3）：356-358.

Li HJ， Zhang GL， Zhang LY， et al. A cell model for studying skeletal muscle ischemia/reperfusion injury［J］. Chin J Appl Physiol， 2005， 21（3）：356-358.

［14］ Bostr?m P， Wu J， Jedrychowki MP， et al. A PGC1-α-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis［J］. Nature， 2012， 481（7382）：463-468.

［15］ Korta P， Poche? E， Mazur-Bialy A. Irisin as a multifunctional protein： implications for health and certain diseases［J］. Medicina （Kaunas）， 2019， 55（8）：485.

［16］ Lee P， Linderman JD， Smith S， et al. Irisin and FGF21 are cold-induced endocrine activators of brown fat function in humans［J］. Cell Metab， 2014， 19（2）：302-309.

Establishment and verification of a mouse myoblast hypoxia/reoxygenation model

XI Ting1， YAO Xiaoguang2△， HU Junli2

［1，830001，；2，，，""，（），830001，］

To establish anmouse myoblast model of intermittent hypoxia/reoxygenation.An O2content of 1% or 4% in the mixture in a three-gas incubator was established as the hypoxic culture condition， and the environment in a carbon dioxide incubator was established as the reoxygenated culture condition. Mouse myoblasts （C2C12） were exposed to different oxygen concentrations （1% and 4%） and reoxygenation cycles （6 h and 8 h）. Then， cell proliferation was detected， and concentrations of glucose， lactate dehydrogenase （LDH） and fibronectin type III domain containing 5 （FNDC5） in C2C12 cell culture medium were measured. In addition， the expression level of the hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α） protein of C2C12 cells under different experimental conditions was detected by Western blot.（1） The 1% oxygen concentration group showed slower cell proliferation， lower FNDC5 content， and higher glucose levels in culture medium， LDH activity， as well as higher HIF-1α protein expression compared to the 4% oxygen concentration group （<0.05）. （2） Under 1% oxygen concentration， the 8 h cycle group showed significantly decreased cell viability compared to the 6 h cycle group （<0.05）.This study simulates the differences in injury status and FNDC5 expression in mouse myoblasts under different hypoxia/reoxygenation conditions. A 1% oxygen concentration and reoxygenation cycle of 6 hours can be used as a better experimental model for C2C12 cells.

mouse myoblasts； intermittent hypoxia； fibronectin type III domain containing 5； hypoxia-inducible factor-1α

1000-4718（2023）07-1339-06

2023-01-30

2023-05-31

0991-8565043； E-mail： yaoxg12345777@163.com

R337.1； R363； R-33

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.07.023

［基金項(xiàng)目］新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 2021D01C173）

（責(zé)任編輯：李淑媛，余小慧）