馮昊， 曹伯雄， 昝自亮， 賀澤民， 黃浩， 皇改改， 魏強△

17β-雌二醇聯(lián)合苯并芘異常激活人肺腺癌A549細(xì)胞中AHR/PD-L1軸*

馮昊1， 曹伯雄1， 昝自亮1， 賀澤民1， 黃浩1， 皇改改2， 魏強1△

（1成都市雙流區(qū)第一人民醫(yī)院胸外科，四川 成都 610000；2成都市雙流區(qū)第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，四川 成都 610000）

探討17β-雌二醇（17β-estradiol， E2）和苯并芘（benzopyrene， BaP）對人肺腺癌A549細(xì)胞程序性死亡配體1（programmed death ligand 1， PD-L1）表達(dá)的影響及其潛在分子機制。分別選用濃度梯度為1～1 000 nmol/L的E2和濃度梯度為0.008～5 μmol/L的BaP處理A549細(xì)胞，篩選出最適濃度；實驗分為對照組、E2組、BaP和E2+BaP組，每組實驗重復(fù)3次。RT-qPCR檢測PD-L1的mRNA水平；Western blot檢測PD-L1、芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor， AHR）和缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α）表達(dá)水平，以及蛋白激酶B（protein kinase B， PKB/AKT）和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2， ERK1/2）的磷酸化水平。分別加入AKT特異性抑制劑LY294002和ERK1/2特異性抑制劑PD98059進行反向驗證，觀察PD-L1表達(dá)的變化。與E2組和BaP組相比，E2+BaP組A549細(xì)胞中PD-L1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)（<0.05）；AHR、HIF-1α、p-AKT和p-ERK1/2蛋白水平均顯著高于其他各組（<0.05）；LY294002和PD98059能夠逆轉(zhuǎn)E2+BaP對A549細(xì)胞PD-L1表達(dá)的上調(diào)作用（<0.05）。E2聯(lián)合BaP可能通過異常激活A(yù)HR-AKT-ERK1/2信號通路誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞PD-L1表達(dá)升高。

雌二醇；苯并芘；程序性死亡配體1；非小細(xì)胞肺癌；AHR-AKT-ERK1/2信號通路

肺癌是常見的惡性腫瘤疾病，發(fā)病率在全球范圍內(nèi)持續(xù)上升，非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer， NSCLC）約占肺癌的85%［1］。吸煙是促進NSCLC的獨立危險因素，大量研究充分證明煙草煙霧會促進NSCLC的發(fā)展［2-4］。早期研究顯示男性吸煙者罹患肺癌的風(fēng)險顯著高于女性吸煙者，然而隨著研究不斷深入，逐漸觀察到在全世界范圍內(nèi)男性NSCLC的發(fā)病率和死亡率開始有所下降，而女性的發(fā)病率和死亡率卻逐年上升［5-6］；更進一步的研究指出，診斷為NSCLC的女性平均吸煙量要比男性低20%～25%［7-8］；同時幾項大型病例對照研究也表明，在同等吸煙水平下，女性患NSCLC的風(fēng)險幾乎是男性的3倍［5-6， 9］。雖然暴露于煙霧的女性NSCLC的發(fā)病率顯著增加已經(jīng)開始受到廣泛關(guān)注，但我們對其發(fā)病機制卻仍知之甚少。

雌激素是類固醇激素，在體內(nèi)主要以17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）的生物活性形式存在。越來越多的研究顯示雌激素可以促進乳腺癌［10］、子宮內(nèi)膜癌［11］、肺癌［12］等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展；不僅如此，還有研究指出，雌激素可以通過調(diào)控免疫檢查點促進腫瘤免疫逃逸［13］。免疫檢查點是指在免疫細(xì)胞上表達(dá)并且能調(diào)節(jié)免疫激活程度的一系列分子，可防止免疫系統(tǒng)過度活化。免疫檢查點的表達(dá)或功能失常是許多疾病發(fā)生的重要原因之一。腫瘤細(xì)胞免疫檢查點通常處于激活狀態(tài)，通過抑制T淋巴細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫耐受，從而促進腫瘤免疫逃逸。目前已經(jīng)證實細(xì)胞程序性死亡受體1（programmed death-1， PD-1）/程序性死亡配體1（programmed death ligand 1， PD-L1）信號通路是多種惡性腫瘤疾病的有效治療靶點［14-15］。PD-1/PD-L1阻斷治療可以在一定程度上延長患者的生存率［16-18］。盡管雌激素對多種腫瘤細(xì)胞PD-1/PD-L1均有調(diào)節(jié)作用，例如目前有研究指出雌激素可以顯著上調(diào)雌激素受體（estrogen receptor， ER）陽性的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)［15］，但是雌激素對肺癌細(xì)胞PD-L1影響的研究卻鮮有報道。因此雌激素是否可以促使肺癌腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)測進而促進NSCLC的發(fā)生發(fā)展仍有待進一步研究。

因此我們推測雌激素可能誘導(dǎo)了一種肺癌細(xì)胞免疫逃逸的反應(yīng)機制，由此我們假設(shè)雌激素可以調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞免疫檢查點，并且在煙霧的刺激下對肺癌細(xì)胞免疫檢查點的調(diào)節(jié)可能具有協(xié)同作用，從而進一步促進腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。為了驗證上述假設(shè)，我們在體外實驗中評估了煙草煙霧的主要成分苯并芘（benzopyrene， BaP）和E2單獨及聯(lián)合作用對人肺腺癌A549細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響及其分子機制，以期為肺癌免疫治療提供參考依據(jù)。

材料和方法

1　細(xì)胞

人肺腺癌細(xì)胞株A549來源于中國科學(xué)院（上海）細(xì)胞庫。

2　主要試劑

E2、BaP、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）、含EDTA的胰蛋白酶和1×磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline， PBS）均為Sigma產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)液為HyClone產(chǎn)品；澳洲優(yōu)級胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）購自CellMax；PD-L1、芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor， AHR）和缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α）兔抗多克隆抗體購自Santa Cruz；蛋白激酶B（protein kinase B， PKB/AKT）、磷酸化AKT（phosphorylated AKT， p-AKT）、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2， ERK1/2）和磷酸化ERK1/2（phosphorylated ERK1/2， p-ERK1/2）兔抗多克隆抗體均購自Cell Signaling Technology；GAPDH鼠抗多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠/兔IgG試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride， PVDF）膜和化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自Millipore；Trizol試劑和PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自TaKaRa；RT-qPCR引物由深圳華大基因公司合成。其他試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

3　主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)和傳代用含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)A549細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱的條件是37 ℃、5% CO2，隔日更換培養(yǎng)液；細(xì)胞密度達(dá)70%～80%融合進行細(xì)胞傳代。每天觀察和記錄細(xì)胞的生長狀態(tài)。

3.2BaP和E2處理A549細(xì)胞及實驗分組取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞置于培養(yǎng)液中，待細(xì)胞密度至30%～50%時，分別選用濃度梯度為1～1 000 nmol/L的E2和濃度梯度為0.008～5 μmol/L的BaP處理A549細(xì)胞，篩選出最適濃度。實驗分為對照（control， Ctrl）組、E2組（最適濃度為100 nmol/L）、BaP組（最適濃度為0.2 μmol/L）和E2+BaP組。每組實驗重復(fù)3次。處理12～24 h后提取細(xì)胞總RNA，用于后續(xù)RT-qPCR檢測；處理48～72 h后提取細(xì)胞總蛋白，用于后續(xù)Western blot檢測。

3.3RT-qPCR法檢測PD-L1 mRNA采用Trizol法分離純化各組細(xì)胞的總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。使用PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA?？偡磻?yīng)體積20.0 μL，其中包括5× RT-PCR buffer 5.0 μL、dNTP Mix 1.0 μL、RT-PCR Enzyme Mix 2.0 μL、RNA 2.0 μg和引物0.6 μmol/L。逆轉(zhuǎn)錄條件如下： 37 ℃ 15 min； 85 ℃ 5 s。RT-qPCR在CFX Connect Real-Time PCR Detection System （Bio-Rad）中進行。樣品混合物由5 μL SYBR、0.8 μL引物、1 μL cDNA和3.2 μL ddH2O組成。熱循環(huán)條件如下： 95 ℃ 10 min； 95 ℃ 20 s， 56 ℃ 10 s，將溫度降低3 ℃/循環(huán)，共35個循環(huán)； 95 ℃ 20 s； 55 ℃ 20 s。引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參照，檢測各組細(xì)胞PD-L1的表達(dá)水平，采用2-ΔΔCt法統(tǒng)計分析相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

表1　引物序列

3.4Western blot法檢測PD-L1、AHR、HIF-1α、AKT、p-AKT、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白水平首先使用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液來制備細(xì)胞裂解液，PBS清洗各組細(xì)胞，細(xì)胞刮刷收集后加入RIPA裂解液，BCA法測定蛋白濃度。250 μg為標(biāo)準(zhǔn)計算蛋白上樣體積，10% SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，首先是在濃縮膠中90 V恒壓濃縮30 min，然后在分離膠中120 V恒壓分離90 min，電泳完成后，進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為210 mA恒流，轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)蛋白分子量大小調(diào)整，轉(zhuǎn)膜完成后將轉(zhuǎn)含有蛋白質(zhì)的PVDF膜放于在5%牛血清白蛋白中37 ℃封閉2 h，封閉結(jié)束后，加入Ⅰ抗（PD-L1抗體，1∶500； AHR抗體，1∶500； HIF-1α抗體，1∶500； p-AKT抗體，1∶1 000； AKT抗體，1∶1 000； p-ERK1/2抗體，1∶1 000； ERK1/2抗體，1∶1 000； GAPDH抗體，1∶1 000），4 ℃孵育過夜，14 h后將膜取出，用1× TBST洗滌3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠/兔IgG（1∶3 000） Ⅱ抗并在37 ℃孵育1 h，1× TBST洗滌3次后通過化學(xué)發(fā)光法顯影。ImageJ軟件計算各電泳條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照，相比較后計算各組蛋白的表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

4　統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 27.0和GraphPad Prism 9軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析，各組之間差異的兩兩比較用LSD-檢驗。以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1　BaP對A549細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響

不同濃度的BaP誘導(dǎo)A549細(xì)胞3 d，Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，0.008～1 μmol/L BaP均可以誘導(dǎo)免疫檢查點蛋白PD-L1表達(dá)升高（<0.05或<0.01），當(dāng)BaP濃度為0.2 μmol/L時，PD-L1表達(dá)升高最為顯著（<0.01），見圖1。

Figure 1.　Effect of benzopyrene （BaP） on PD-L1 expression in A549 cells was detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs Ctrl group.

2　E2對A549細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響

不同濃度的E2誘導(dǎo)A549細(xì)胞3 d，Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，10～1 000 nmol/L E2均可誘導(dǎo)免疫檢測點蛋白PD-L1表達(dá)升高（<0.05或<0.01），當(dāng)E2濃度為100 nmol/L時，PD-L1表達(dá)升高最為顯著（<0.01），見圖2。

Figure 2.　Effect of 17β-estradiol （E2） on PD-L1 expression in A549 cells was detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs Ctrl group.

3　E2聯(lián)合BaP對A549細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響

根據(jù)分組采用不同條件誘導(dǎo)A549細(xì)胞3 d，Western blot檢測結(jié)果顯示，在A549細(xì)胞中，與單獨使用E2（濃度為100 nmol/L）組和單獨使用BaP（濃度為0.2 μmol/L）組相比，E2+BaP組PD-L1蛋白表達(dá)水平顯著升高（<0.05），見圖3A。根據(jù)分組采用不同條件誘導(dǎo)A549細(xì)胞1 d，RT-qPCR結(jié)果顯示，與單獨使用E2（濃度為100 nmol/L）組和單獨使用BaP（濃度為0.2 μmol/L）組相比，E2+BaP組PD-L1的mRNA表達(dá)水平顯著升高（<0.05），見圖3B。

Figure 3.　Effects of 17β-estradiol （E2） combined with benzopyrene （BaP） on PD-L1 protein （A） and mRNA （B） expression in A549 cells were detected by Western blot and RT-qPCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs Ctrl group； #P<0.05 vs E2+BaP group.

4　E2聯(lián)合BaP對AHR-AKT-ERK1/2信號通路的影響

根據(jù)分組采用不同條件誘導(dǎo)A549細(xì)胞3 d，Western blot檢測AHR和HIF-1α的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，E2+BaP組蛋白表達(dá)水平顯著高于E2和BaP組（<0.05）；根據(jù)分組采用不同條件誘導(dǎo)A549細(xì)胞8 h，Western blot檢測p-AKT和p-ERK1/2蛋白水平，結(jié)果顯示，E2+BaP組AKT和ERK1/2的磷酸化水平均顯著升高（<0.05）；而細(xì)胞總AKT和ERK1/2表達(dá)量各組之間沒有顯著差異，見圖4A。加入AKT信號通路抑制劑LY294002（10 mmol/L）和ERK1/2信號通路抑制劑PD98059（10 mmol/L），Western blot結(jié)果顯示，與E2+BaP組相比，E2+BaP+LY294002組PD-L1蛋白表達(dá)水平顯著降低（<0.05）；同樣，與E2+BaP組相比，E2+BaP+PD98059組PD-L1蛋白表達(dá)水平亦顯著降低（<0.05），見圖4B。

Figure 4.　The role of AHR-AKT-ERK1/2 signaling pathway in A549 cells treated with 17β-estradiol （E2）+benzopyrene （BaP）. A： the protein levels of AHR， HIF-1α， p-AKT and p-ERK1/2 in A549 cells were detected by Western blot； B： PD-L1 protein levels were analyzed by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs Ctrl group； #P<0.05 vs E2+BaP group.

討論

吸煙女性的NSCLC發(fā)病率正逐年增加［19］，然而在煙霧的暴露下，雌激素可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的反應(yīng)機制仍需要詳細(xì)闡明。我們的數(shù)據(jù)表明E2可以增強A549細(xì)胞AHR/PD-L1的表達(dá)，并且我們的結(jié)果顯示在BaP與E2協(xié)同作用下，A549細(xì)胞AHR/PD-L1的表達(dá)水平有更為顯著的升高。這些檢測結(jié)果為雌激素促進腫瘤細(xì)胞免疫逃逸提供了新的證據(jù)。

吸煙是促進NSCLC發(fā)生發(fā)展的獨立危險因素，煙霧中誘發(fā)肺癌的致癌物至少有50種，BaP是常見的導(dǎo)致肺癌的有害成分［20-21］，既往大量研究證明，BaP可以促進腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移以及抑制其凋亡［2-3］。Wang等［22］在研究中指出，BaP可以通過上調(diào)免疫檢查點PD-1/PD-L1促使NSCLC細(xì)胞發(fā)生免疫逃避，并且可以促進小鼠肺腺癌細(xì)胞的增殖。我們的結(jié)果顯示0.2 μmol/L BaP可以顯著上調(diào)PD-L1的蛋白水平，這一結(jié)果與先前的研究結(jié)果相一致［2-3，22］，提示BaP可以促進A549細(xì)胞PD-L1的表達(dá)升高。

既往研究表明內(nèi)環(huán)境中炎癥因子、外泌體、微小RNA等均可以調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫檢查點，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸［23-25］。目前越來越多的證據(jù)指出雌激素同樣可能對促進腫瘤細(xì)胞免疫逃逸起著重要作用。Yang等［15］在研究中指出，E2通過調(diào)控AKT信號通路促進ER表達(dá)陽性的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的PD-L1的升高，Williams等［26］也觀察到E2在突變型乳腺癌中可能通過激活ER和干擾素刺激基因上調(diào)腫瘤細(xì)胞及巨噬細(xì)胞PD-L1的表達(dá)水平。不僅在腫瘤領(lǐng)域，E2在抗磷脂綜合征等自身免疫性疾病、子宮內(nèi)膜異位等疾病中可以通上調(diào)CD4+、CD8+T細(xì)胞以及腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6從而促進PD-L1的表達(dá)［27-28］。然而E2對NSCLC細(xì)胞的免疫檢查點的調(diào)節(jié)機制卻仍有待進一步闡明。我們的研究結(jié)果顯示E2以劑量依賴的形式上調(diào)PD-L1，進一步研究顯示，BaP與E2對于A549細(xì)胞PD-L1的表達(dá)上調(diào)具有協(xié)同作用，提示BaP與E2可能對誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞的免疫逃逸具有協(xié)同作用。

AHR在腫瘤的免疫逃逸中扮演了重要角色［22］。AHR是一種最早被檢測的環(huán)境污染物多環(huán)芳香烴類（polycyclic aromatic hydrocarbons， PAHs）的受體［29］。這種受體在人胎盤、肺、胸腺、腎臟、肝臟等幾乎所有組織中均有表達(dá)［30-31］，與其配體結(jié)合并易位至細(xì)胞核后，通過調(diào)控HIF-1α核蛋白，不僅能調(diào)節(jié)下游涉及MAPK/PI3K/AKT、ERK1/2、NF-κB［22， 32］等多種配體特異性靶基因的表達(dá)，甚至在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答［31］中也起重要作用。Wang等［22］的研究也指出，在NSCLC中AHR介導(dǎo)了BaP對肺癌細(xì)胞的促進作用，并且通過阻斷PD-1/PD-L1免疫檢查點抑制BaP誘導(dǎo)的肺癌發(fā)展，說明PD-L1與AHR之間可能存在一定聯(lián)系。我們的結(jié)果顯示BaP聯(lián)合E2可以顯著提高A549細(xì)胞AHR/HIF-1α的表達(dá)水平。通過進一步研究，我們的結(jié)果還顯示在BaP和E2聯(lián)合作用下p-AKT和p-ERK1/2蛋白水平均顯著提高，并且在加入ATK信號通路抑制劑LY294002和ERK1/2信號通路抑制劑PD98059后，PD-L1的表達(dá)水平顯著降低，這些結(jié)果提示BaP和E2聯(lián)合作用可能通過激活A(yù)KT和ERK1/2信號通路從而促進PD-L1的表達(dá)。

綜上所述，E2聯(lián)合BaP共同作用A549細(xì)胞，通過上調(diào)AHR/HIF-1α水平，激活A(yù)KT和ERK1/2信號通路，從而顯著增強PD-L1表達(dá)。由此推測，在煙霧的刺激下，E2可能是增強NSCLC細(xì)胞免疫逃逸的重要調(diào)節(jié)因子。因此E2-AHR-AKT-ERK1/2-PD-L1軸可能成為NSCLC的潛在治療靶點，我們在后續(xù)體內(nèi)、體外實驗中會進一步探究E2調(diào)節(jié)的AHR-AKT-ERK1/2信號通路上下游分子機制。盡管具有一定局限性，但本研究顯示E2聯(lián)合BaP能促進A549細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，此機制可能參與了NSCLC細(xì)胞的免疫逃逸過程。

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17β-Estradiol combined with benzopyrene abnormally activates AHR/PD-L1 axis in human lung adenocarcinoma A549 cells

FENG Hao1， CAO Boxiong1， ZAN Ziliang1， HE Zemin1， HUANG Hao1， HUANG Gaigai2， WEI Qiang1△

（1，，610000，；2，，610000，）

To investigate the effects of 17β-estradiol （E2） and benzopyrene （BaP） on programmed death ligand 1 （PD-L1） expression in human lung adenocarcinoma A549 cells and their potential molecular mechanisms.The A549 cells were treated with 1～1 000 nmol/L E2and 0.008～5 μmol/L BaP， and the optimal concentrations were identified. The cells were divided into control group， E2group， BaP group， and E2+BaP group. Each set of experiments was repeated 3 times. RT-qPCR was used to determine the mRNA level of PD-L1. Western blot was used to detect the expression levels of PD-L1， aryl hydrocarbon receptor （AHR） and hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α）， as well as the phosphorylation levels of protein kinase B （PKB/AKT） and extracellular signal-regulated kinase 1/2 （ERK1/2）. The AKT-specific inhibitor LY294002 and ERK1/2-specific inhibitor PD98059 were used for reverse verification， and the changes in PD-L1 expression were observed.Compared with E2group and BaP group， the mRNA and protein levels of PD-L1 in the A549 cells of E2+BaP group were significantly up-regulated （<0.05）. The protein levels of AHR， HIF-1α， p-AKT and p-ERK1/2 in E2+BaP group were significantly higher than those in other groups （<0.05）. LY294002 and PD98059 reversed the up-regulation of PD-L1 induced by E2+BaP （<0.05）.E2combined with BaP up-regulates PD-L1 expression in human lung adenocarcinoma A549 cells through abnormal activation of the AHR-AKT-ERK1/2 signaling pathway.

estradiol； benzopyrene； programmed death ligand-1； non-small-cell lung cancer； AHR-AKT-ERK1/2 signaling pathway

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.07.003

［基金項目］成都市衛(wèi)生健康委員會醫(yī)學(xué)科研基金資助項目（No. 2021104）

R363.2； R734.2

A

1000-4718（2023）07-1174-07

2023-04-12

2023-06-16

18180692239； E-mail： weiqiang011732@126.com

（責(zé)任編輯：余小慧，李淑媛）