白凱紅 阿別小兵 許曉麗 蔣娜 李健強(qiáng) 羅來鑫

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部有害生物監(jiān)測與綠色管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/種子病害檢驗(yàn)與防控北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，100193，北京）

苦蕎（Fagopyrum tataricum）又名韃靼蕎麥，是蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum）的一年生雙子葉草本植物，是蕎麥主要栽培種之一[1-2]，主要分布在四川、云南和貴州等地區(qū)[3]，其中四川省涼山地區(qū)是我國蕎麥起源中心之一，被譽(yù)為“苦蕎麥之鄉(xiāng)”，擁有全國乃至全世界最豐富的苦蕎種質(zhì)資源，是苦蕎種類最多樣、種植面積最廣泛、分布最集中的地區(qū)[3-5]?？嗍w作為當(dāng)?shù)氐闹饕Z食之一，在涼山地區(qū)的17 個(gè)縣均有種植，其中越西、昭覺、喜德、冕寧和美姑等縣是苦蕎的主產(chǎn)區(qū)[6-7]。

截至目前，已報(bào)道的蕎麥真菌性病害共有14種，包括白粉病、立枯病、霜霉病、核盤菌根霉病、葉斑病、枯萎病、壞斑病、褐斑病、白霉病、斑枯病、輪紋病、灰霉病、殼二孢疫病和鐮刀菌根腐病[2]，這些病害使蕎麥的產(chǎn)量與品質(zhì)受到極大的影響。這些病害大多危害蕎麥葉部和根部，但對病原菌初侵染來源并未有太多涉及，對蕎麥種子攜帶真菌的狀況更是鮮有報(bào)道。種子攜帶病原物不僅是直接引起作物田間病害流行的重要初侵染來源之一，而且也是病害跨地區(qū)遠(yuǎn)距離傳播的重要途徑之一[8]。發(fā)展種子健康檢測技術(shù)等是通過種子處理的方法降低種子攜帶病原物的基礎(chǔ)，可最大限度控制種傳病害的傳播，實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)增收。種子健康檢測技術(shù)主要有直接檢測和洗滌檢測、瓊脂培養(yǎng)檢測、免疫血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測等[9]，近年來檢測通量大、成本低和速度快的高通量測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用，但在蕎麥種子健康檢測中還未見報(bào)道。

本研究同時(shí)運(yùn)用分離培養(yǎng)法和基于18S rRNA基因擴(kuò)增子測序法，對涼山主要產(chǎn)區(qū)的苦蕎種子內(nèi)部及外部真菌進(jìn)行檢測，旨在明確涼山州苦蕎種子攜帶真菌的多樣性，為種子處理和病害防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

苦蕎種子樣品采自四川省涼山州越西縣爾賽鄉(xiāng)依達(dá)村、越西縣爾賽鄉(xiāng)洪洛村、越西縣爾賽鄉(xiāng)花古村、昭覺縣谷曲鄉(xiāng)新涼村、昭覺縣灑拉地破、昭覺縣解放溝、喜德縣博洛拉達(dá)鄉(xiāng)博洛村、喜德縣博洛拉達(dá)鄉(xiāng)火普村、冕寧縣回坪鄉(xiāng)廟高山村、普格縣五道箐鄉(xiāng)采洛洛博村、美姑縣覺羅鄉(xiāng)地莫村和鹽源縣干海鄉(xiāng)滑泥村。46 份苦蕎種子用于種子內(nèi)部及外部真菌檢測，其中選取不同地方的13 份種子用于18S rRNA 基因擴(kuò)增子測序，其中種子樣品MNCQ-1、MNCQ-4、PGEL-1、YYQK-6、YYCQ-3、MGYQ-2、MGXQ-2、MGCQ-2 為已知品種，分別是川蕎1號(hào)、川蕎4 號(hào)、額拉、黔苦6 號(hào)、川蕎3 號(hào)、云蕎2 號(hào)、西蕎2 號(hào)、川蕎2 號(hào)，具體信息見表1。

表1 四川省涼山州苦蕎種子樣品信息Table 1 The information of tartary buckwheat seeds from Liangshan of Sichuan province

1.2 分離培養(yǎng)法檢測

1.2.1 外部真菌檢測 從46 份苦蕎種子樣品中，各隨機(jī)選取100 粒種子置于50mL 滅菌三角瓶中，并加入10mL 無菌水，置于搖床上振蕩30min（120轉(zhuǎn)/min）后，吸取1mL 上清液，進(jìn)行10 倍系列梯度稀釋并在PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行涂板。涂布后的培養(yǎng)基平板封口后置于25°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d 后開始觀察記錄，并進(jìn)行真菌的分離與純化。

1.2.2 內(nèi)部真菌檢測 從46 份苦蕎種子樣品中，各隨機(jī)選取100 粒種子用1% NaClO 溶液進(jìn)行消毒處理10min 后，用滅菌水進(jìn)行3 次洗滌，用滅菌的吸水紙吸去種子表面的水分，風(fēng)干后將種子擺在直徑9cm 的PDA 培養(yǎng)基平板上，每皿擺放10 粒種子，置于25℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)2d 后開始觀察記錄，并進(jìn)行真菌的分離與純化。

1.2.3 形態(tài)學(xué)鑒定 在載玻片上滴加10μL 無菌水，用接種針挑取少量真菌培養(yǎng)物，置于載玻片的無菌水中，并使其盡量分散，蓋上蓋玻片，利用Olympus 1X 71 倒置顯微鏡對菌絲和孢子形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定 用CTAB法對真菌總DNA進(jìn)行提取，利用通用引物ITS4/ITS5（TCCT CCGCTTATTGATATGC/GGAAGTAAAAGTCGTA ACAAGG）[10]擴(kuò)增18S rRNA 基因序列。PCR 體系（25.00μL）為16.85μL ddH2O、2.50μL 10×rTaqDNA 聚合酶緩沖液、2.40μL dNTPs（每種均為2.5mmol/L）、1.00μL 上游引物（10μmol/L）、1.00μL下游引物（10μmol/L）、0.25μLrTaqDNA 聚合酶（2.5U/μL）、1.00μL DNA 模板。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C 預(yù)變性10min；95°C 變性30s，55°C 退火30s，72°C 延伸1min，35 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸10min。將符合目標(biāo)條帶的樣品送北京博邁德科技發(fā)展有限公司進(jìn)行測序，并將所得序列在NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對。

1.3 18S rRNA 基因擴(kuò)增子測序法檢測

1.3.1 樣品預(yù)處理 檢測種子外部攜帶真菌是將100 ?？嗍w種子置于滅菌的50mL 離心管，加入10mL 滅菌水，渦旋震蕩5min，種子洗脫液轉(zhuǎn)移至新管中備用；對于內(nèi)部寄藏真菌的檢測：隨機(jī)稱取0.3～0.5g 種子，并用1% NaClO 溶液進(jìn)行消毒處理10min 后，用滅菌水洗滌3 次，用滅菌的吸水紙吸去種子表面的水分，風(fēng)干后將種子用液氮速凍后研磨成粉末備用。

1.3.2 DNA 提取和文庫構(gòu)建 利用DNA 提取試劑盒Omega-soil DNA Kit（Omega Bio-Tek）對基因組DNA 進(jìn)行抽提，利用擴(kuò)增18S rRNA 的引物SSU0817F/SSU1196R（TTAGCATGGAATAATRRA ATAGGA/TCTGGACCTGGTGAGTTTCC）[11]進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以檢測是否滿足后續(xù)擴(kuò)增子測序要求。滿足要求后，通過文庫構(gòu)建，進(jìn)行Miseq 測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測序平臺(tái)得到的下機(jī)數(shù)據(jù)（Raw Data）需要經(jīng)過數(shù)據(jù)拆分、去引物序列、PE Reads 拼接、Tags 質(zhì)量及長度過濾和截取以及去嵌合體后獲得最終的有效數(shù)據(jù)（Effective Tag），之后進(jìn)行物種注釋和分析：利用Uparse（http://www.drive5.com/uparse/）和Usearch（http://www.drive5.com/usearch/）進(jìn)行OTU（Operational Taxonomic Units）分析，采用RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析；利用Mothur（version v.1.30.2 https://mothur.org/wiki/calculators/）進(jìn)行Alpha 多樣性分析；利用Qiime 和R 語言（version 3.3.1）進(jìn)行Beta 多樣性分析，明確物種的豐富度和多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離培養(yǎng)法對苦蕎種子攜帶真菌的檢測與鑒定

對苦蕎種子攜帶的真菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，從種子內(nèi)部共獲得786 株分離物，種子外部共獲得594 株分離物。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，從種子內(nèi)部獲得的786 株分離物隸屬于15 個(gè)屬，分別為葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）、梭孢殼屬（Thielavia）、炭疽屬（Colletotrichum）、平臍蠕孢屬（Bipolaris）、彎孢屬（Curvularia）、鏈格孢屬（Alternaria）、裂褶菌屬（Schizophyllum）、曲霉屬（Aspergillus）、擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）、鐮刀菌屬（Fusarium）、木霉屬（Trichoderma）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）、Myrmaecium、毛殼菌屬（Chaetomium）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）；從種子外部獲得的594 株分離物隸屬于12 個(gè)屬，分別為橫梗霉屬（Lichtheimia）、青霉屬（Penicillium）、鏈格孢屬（Alternaria）、裂褶菌屬（Schizophyllum）、曲霉屬（Aspergillus）、擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）、鐮刀菌屬（Fusarium）、木霉屬（Trichoderma）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）、Myrmaecium、毛殼菌屬（Chaetomium）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）。因此，從苦蕎種子中共鑒定得到17 個(gè)屬的真菌，分別為葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）、平臍蠕孢屬（Bipolaris）、梭孢殼屬（Thielavia）、擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）、Myrmaecium、炭疽屬（Colletotrichum）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）、毛殼菌屬（Chaetomium）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）、木霉屬（Trichoderma）、曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、鏈格孢屬（Alternaria）、彎孢屬（Curvularia）、裂褶菌屬（Schizophyllum）、鐮刀菌屬（Fusarium）。具體分離物的菌落形態(tài)和孢子形態(tài)如圖1 所示，且上述真菌的18S rRNA 基因序列與NCBI 上已知對應(yīng)屬的真菌序列的比對結(jié)果相似度均在99%以上。

圖1 苦蕎種子攜帶的部分真菌分離物在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及孢子形態(tài)Fig.1 The colony morphology and its spore morphology of tartary buckwheat seeds carrying fungal isolates on PDA medium

苦蕎種子真菌分離物的分離頻率和優(yōu)勢菌群統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2 所示，內(nèi)部寄藏的真菌分離物中鐮刀菌屬（Fusarium）的分離頻率最高，為34.4%，擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）、青霉菌屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus）分別為27.1%、18.3%和17.1%，其他菌群為3.1%（圖2a）。外部攜帶的真菌分離物中優(yōu)勢真菌為鏈格孢屬（Alternaria），占比36.2%，裂褶菌屬（Schizophyllum）、木霉屬（Trichoderma）和葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）的分離占比分別為22.1%、15.9%和14.2%，其他菌群為11.6%（圖2b）。

圖2 基于分離培養(yǎng)法對供試苦蕎種子攜帶真菌的優(yōu)勢菌群分析Fig.2 Analysis of dominant microflora from tartary buckwheat seeds based on isolation and culture method

2.2 基于18S rRNA 基因擴(kuò)增子測序結(jié)果

2.2.1 OTU 分析 基于18S rRNA 基因擴(kuò)增子測序法，13 份供試苦蕎種子攜帶真菌群落物種分類統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下，內(nèi)部寄藏真菌序列被劃分為1 個(gè)域（Domain）、5 個(gè)界、7 個(gè)門、19 個(gè)綱（Class）、27 個(gè)目（Order）、35 個(gè)科、39 個(gè)屬、42 個(gè)種，共48 個(gè)OTUs；外部攜帶真菌序列被劃分為1 個(gè)域、5 個(gè)界、8 個(gè)門、21 個(gè)綱、31 個(gè)目、38 個(gè)科、41個(gè)屬、45 個(gè)種，共57 個(gè)OTUs。

2.2.2 Alpha 多樣性分析 對于Alpha 多樣性分析，Ace 指數(shù)越高，表示菌群物種種類越豐富。結(jié)果（圖3a）表明，供試種子內(nèi)部真菌的多樣性為MNCQ-1（冕寧縣）＞ZJ-5（昭覺縣）＞PGEL-1（鹽源縣）＞XD-10（喜德縣）＞ZJ-1（昭覺縣）＞MGYQ-2（美姑縣）＞YYCQ-3（鹽源縣）＞ZJ-10（昭覺縣）＞MGXQ-2（美姑縣）＞YYQK-6（鹽源縣）＞MNCQ-4（冕寧縣）＞MGCQ-2（美姑縣）＞YX-7（越西縣）；外部真菌群落多樣性為PGEL-1（鹽源縣）＞MNCQ-4（冕寧縣）＞MGCQ-2（美姑縣）＞MNCQ-1（冕寧縣）＞XD-10（喜德縣）＞YYCQ-3（鹽源縣）＞MGXQ-2（美姑縣）＞MGYQ-2（美姑縣）＞ZJ-1（昭覺縣）＞ZJ-5（昭覺縣）＞YYQK-6（鹽源縣）＞ZJ-10（昭覺縣）＞YX-7（越西縣）（圖3b）。同一地區(qū)的不同供試苦蕎種子無論在內(nèi)部寄藏還是外部攜帶真菌的豐度都存在明顯差異，同一樣品種子內(nèi)部與外部真菌的豐度也有所不同。

圖3 基于18S rRNA 基因擴(kuò)增子測序?qū)┰嚨?3 份苦蕎種子攜帶真菌的Alpha 多樣性的評估結(jié)果Fig.3 Alpha diversity estimators of 13 tartary buckwheat seeds carrying fungi by 18S rRNA amplicon sequencing

對苦蕎種子內(nèi)部寄藏和外部攜帶真菌的物種組成進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4a 所示，種子內(nèi)部寄藏真菌主要有核盤菌屬（Sclerotinia）、隱球菌屬（Cryptococcus）、枝孢菌屬（Cladosporium）、Boeremia、短梗霉屬（Aureobasidium）和旋孢腔菌屬（Cochliobolus），另外還有未鑒定到屬的群落，有胚植物亞界（Embryophyta）、發(fā)菌科（Trichocomaceae）、座囊菌綱（Dothideomycetes）、銀耳目（Tremellales）等；外部攜帶真菌的物種組成如圖4b 所示，有核盤菌屬（Sclerotinia)、枝孢菌屬（Cladosporium）、隱球菌屬（Cryptococcus）、Boeremia、短梗霉屬（Aureobasidium）和球腔菌屬（Mycosphaerella），另外還有未鑒定到屬的菌群如下，發(fā)菌科、銀耳目、座囊菌綱和Cystofilobasidiaceae等。在種子內(nèi)部寄藏和外部攜帶真菌中均能鑒定到核盤菌屬（Sclerotinia）、隱球菌屬（Cryptococcus）、枝孢菌屬（Cladosporium）、Boeremia和短梗霉屬（Aureobasidium），其中核盤菌屬（Sclerotinia）在所有鑒定到的菌群中占比最高，且在13 份供試苦蕎種子中均能檢測鑒定到。

圖4 基于18S rRNA 基因擴(kuò)增子測序?qū)┰嚨?3 份苦蕎種子攜帶真菌的物種組成分析結(jié)果Fig.4 Community analysis of 13 tartary buckwheat seeds carrying fungi by 18S rRNA amplicon sequencing

2.2.3 Beta 多樣性分析 13 份苦蕎種子樣品內(nèi)部寄藏真菌的樣本層級聚類分析結(jié)果如圖5a 所示，有的同一地區(qū)的樣品會(huì)聚在一起，例如來自于昭覺縣的樣品ZJ-1、ZJ-5 和ZJ-10；來自冕寧縣的樣品MNCQ-1 和MNCQ-4。有的同一地區(qū)的樣品并沒有聚類在一支，例如來自美姑縣的樣品MGCQ-2、MGXQ-2 和MGYQ-2；來自鹽源縣的樣品YYQK-6 和YYCQ-3。13 份樣品中來自越西縣的樣品YX-7 與其他樣品的差異性最大，來自鹽源縣的樣品YYQK-6 與來自美姑縣的樣品MGXQ-2 差異性最小。外部攜帶真菌的樣品層級聚類分析結(jié)果如圖5b 所示，不同種子樣品外部攜帶真菌的差異性大，即使來自同一個(gè)地方的樣品也沒有聚到一支，其中13 份樣品中來自越西縣的樣品YX-7與其他樣品的差異性最大，來自鹽源縣的樣品YYCQ-3 與普格縣的樣品PGEL-1 的差異性最小?？嗍w種子內(nèi)部寄藏真菌PCA 分析結(jié)果如圖5c 所示，來自冕寧縣、美姑縣、昭覺縣的種子樣品能聚到一起，說明這些地點(diǎn)樣品真菌群落多樣性相近，而來自鹽源縣的種子樣品并沒有聚到一起，說明真菌群落多樣性差異大。其中來自越西縣的樣品與其他差異性最大，來自昭覺縣和喜德縣的種子樣品菌群多樣性相近，喜德縣種子樣品同時(shí)與美姑縣樣品相近，美姑縣樣品又與鹽源縣樣品相近，鹽源縣樣品與冕寧縣的樣品相近?？嗍w種子外部攜帶真菌群體多樣性分析結(jié)果如圖5d 所示，來自同一個(gè)地區(qū)的不同種子樣品并沒有聚類到一起，說明攜帶真菌的群落差異性大，其中來自越西縣的樣品與其他種子樣品群落多樣性差異性最大。

圖5 基于18S rRNA 基因擴(kuò)增子測序?qū)┰嚨?3 份苦蕎種子攜帶真菌的樣本層級聚類分析Fig.5 Sample hierarchy clustering analysis of 13 tartary buckwheat seeds carrying fungi by 18S rRNA amplicon sequencing

3 討論

從本研究鑒定得到的真菌分離物可以看出，除了引起蕎麥輪紋病的莖點(diǎn)霉屬（Phoma）、蕎麥根腐病的鐮刀菌屬（Fusarium）與葉斑病的鏈格孢屬（Alternaria）外[12-14]，其余屬均未見報(bào)道，原因可能是已有報(bào)道主要以葉片和根部的真菌病害為研究對象，關(guān)于種子攜帶的包括病原菌在內(nèi)的真菌類群研究較少，但本研究新發(fā)現(xiàn)的真菌分離物是否為苦蕎的病原菌還有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

基于18S rRNA 基因擴(kuò)增子測序從種子內(nèi)部共獲得39 個(gè)屬，從種子外部共獲得41 個(gè)屬。其中核盤菌屬（Sclerotinia）同時(shí)為苦蕎種子內(nèi)部寄藏真菌與外部攜帶真菌的優(yōu)勢菌群，有研究[15-16]報(bào)道，Sclerotinia sclerotiorum能引起蕎麥的根腐病。在傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法中鑒定到的鏈格孢屬和鐮刀菌屬，在18S rRNA 基因擴(kuò)增子測序中并沒有鑒定到，可能是由于核盤菌屬等其他優(yōu)勢菌群擴(kuò)增時(shí)掩蓋了豐度極低的菌群。相反，在分離培養(yǎng)法中并未鑒定到核盤菌屬，推測可能是因?yàn)镻DA 培養(yǎng)基上核盤菌屬生長緩慢，被生長快速的菌所覆蓋，因此沒有被檢測到。由于高通量測序法的測序通量大，能鑒定到更多屬，而分離培養(yǎng)法能檢測到豐度極低的菌，因此如果想知道群落的多樣性，高通量測序與分離培養(yǎng)法結(jié)合是更準(zhǔn)確的檢測方法。

18S rRNA 基因擴(kuò)增子測序聚類結(jié)果表明，來自昭覺縣與喜德縣的種子樣品真菌群落多樣性相似，來自鹽源縣與冕寧縣的種子樣品真菌群落多樣性相似，推測是因?yàn)榈乩砩舷驳驴h和昭覺縣相鄰，鹽源縣和冕寧縣相鄰，可能是由于種子的流動(dòng)性或病原菌孢子在風(fēng)力等作用下的傳播，產(chǎn)生交叉污染，致使2 個(gè)地方種子攜帶真菌的多樣性相似。另外，越西縣雖然與冕寧縣、喜德縣、昭覺縣、美姑縣相鄰，但菌群多樣性與其他地方差異大，具體原因還需要對品種進(jìn)行鑒定，并對地形和種子貿(mào)易進(jìn)行研究，看是否由于山脈阻擋了病原物的傳播或種子貿(mào)易限制了種子的流動(dòng)性，致使群落的差異性大。

4 結(jié)論

基于分離培養(yǎng)法和18S rRNA 基因擴(kuò)增子測序法對我國苦蕎主產(chǎn)區(qū)四川涼山州有代表性的46 份苦蕎種子的檢測結(jié)果表明，鐮刀菌屬（Fusarium）和鏈格孢屬（Alternaria）分別是種子內(nèi)部和外部能夠分離培養(yǎng)得到的優(yōu)勢菌群，核盤菌屬（Sclerotinia）則是擴(kuò)增子測序法得到的苦蕎種子內(nèi)、外部優(yōu)勢菌群，不同方法分析得到的優(yōu)勢菌群存在一定差異，擴(kuò)增子測序法得到的總真菌類群大于分離培養(yǎng)法。2種方法檢測得到的多個(gè)真菌屬均為潛在的苦蕎病原菌，且部分屬在蕎麥上未見報(bào)道。不同地區(qū)的種子樣品、同一地區(qū)的不同樣品、及同一樣品的種子內(nèi)部與外部帶菌情況均在多樣性上存在差異。