周焱 周欣 齊旭升

肺炎是兒童常見的呼吸道感染性疾病, 其中重癥肺炎占7%～13%, 臨床表現(xiàn)為氣促、呼吸困難、持續(xù)性低氧血癥等, 易誘發(fā)呼吸衰竭、肺性腦病及多器官臟器功能衰竭, 近60%不良預(yù)后患兒不能明確病原體, 延誤治療［1］。致病菌的檢出對疾病的精確診斷、指導(dǎo)臨床用藥、減少住院時間、改善預(yù)后至關(guān)重要［2］。宏基因組二代測序(metagenomics next-generation sequencing, mNGS)作為新興的檢驗技術(shù), 不依賴傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng), 不需要特異性擴(kuò)增, 不需要預(yù)定假設(shè),能一次性同時對上百萬條DNA 分子進(jìn)行測序, 與信息庫進(jìn)行對比分析, 即可明確樣本中所含病原微生物的種類及數(shù)量［3］, mNGS 繞過了微生物的分離及培養(yǎng)過程, 具有病原體檢出性率高、快速、準(zhǔn)確等特點, 且不受抗生素及激素使用等因素的影響。目前mNGS 已逐步應(yīng)用于臨床疑難感染性疾病的診斷, 對呼吸道感染、神經(jīng)系統(tǒng)感染、血行感染、關(guān)節(jié)腔感染均發(fā)揮著顯著作用, 本研究旨在探討mNGS 技術(shù)對兒童重癥肺炎的臨床指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019 年10 月～2023 年1 月于本院兒科重癥監(jiān)護(hù)病房(PICU)住院治療的71 例重癥肺炎患兒的臨床資料, 均行mNGS 檢測, 其中男43例, 女28例；月齡9.0(3.0～21.0)個月, 治愈出院62例?；純杭覍倬炇鹬橥? 本研究獲醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①年齡<14 歲；②滿足重癥肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］；③樣本均送檢同一家公司(本研究送檢單位為華大基因公司)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①原發(fā)性免疫缺陷；②肺部腫瘤性疾??；③心力衰竭導(dǎo)致的肺水腫；④臨床資料不完整。

1.3 研究方法

1.3.1 資料搜集 臨床資料收集包括性別、年齡、PICU 住院天數(shù)、是否有先天性心臟病、是否使用抗生素、是否機(jī)械通氣及治愈出院情況。實驗室檢測包括WBC、PLT、Hb、PCT、氧合指數(shù)、LDH。

1.3.2 檢測方法 取患兒的深部痰液或支氣管肺泡灌洗液作為標(biāo)本, 均行mNGS 外送檢查, 同時行傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(traditional pathogen detection, TPD)。規(guī)范采集mNGS 送檢標(biāo)本, 樣本的儲存及運送標(biāo)準(zhǔn)參考專家共識［5］。送檢華大基因公司, 行病原微生物DNA 高通量測序, 根據(jù)測序結(jié)果與病原學(xué)文庫對比進(jìn)行信息分析,得出最終報告。TPD 包括：①培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)：痰液和支氣管肺泡灌洗液細(xì)菌及真菌培養(yǎng)、支原體培養(yǎng)、抗酸染色；②聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)：呼吸道合胞病毒、腺病毒、甲型流感病毒、鼻病毒、乙型流感病毒、博卡病毒、副流感病毒、偏肺病毒、EB 病毒、支原體、衣原體；③血清學(xué)檢測：腺病毒抗體、支原體抗體、EB 病毒抗體。

1.3.3 mNGS 報告解讀標(biāo)準(zhǔn) mNGS 報告的解讀尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn), 本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)［6］, 滿足以下至少1 條標(biāo)準(zhǔn), 可認(rèn)為是致病菌, 判定標(biāo)準(zhǔn)：①mNGS 與TPD 結(jié)果均提示為同種病原體, 并排除污染、定植因素；②mNGS 與TPD 結(jié)果不一致, 但根據(jù)患兒臨床表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)、實驗室檢查綜合判斷符合該病原特點；③針對用藥后, 患兒病情緩解。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t 檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距［M(P25, P75)］表示, 兩組獨立樣本采用Mann-Whitney U 檢驗。計數(shù)資料以率(%)表示, 組間比較采用χ2檢驗。一致性判定采用Kappa 檢驗, 顯著性比較采用配對χ2檢驗(McNemar test)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mNGS 與TPD 病原體檢測結(jié)果比較 71 例患兒經(jīng)mNGS 病原體檢測陽性66 例, 陽性率為93.0%；TPD 病原體檢測陽性51 例, 陽性率為71.8%；兩者病原體檢測結(jié)果一致性較差(Kappa=0.234), mNGS 病原體檢測陽性率顯著高于TPD, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001<0.05)。見表1。

表1 mNGS 與TPD 病原體檢測結(jié)果(n)

2.2 mNGS 與TPD 細(xì)菌檢測結(jié)果比較 TPD 細(xì)菌檢測陽性率為38.0%(27/71), 培養(yǎng)時間為(79.2±15.7)h；mNGS 細(xì)菌檢測陽性率為67.6%(48/71), 檢出時間為(54.0±16.9)h。兩者細(xì)菌檢測陽性率一致性較差(Kappa=0.299), mNGS 細(xì)菌檢測陽性率顯著高于TPD,檢出時間顯著短于TPD, 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 mNGS 與TPD 細(xì)菌檢測結(jié)果(n)

2.3 mNGS 細(xì)菌檢測陽性的影響因素分析 71 例患兒經(jīng)mNGS 細(xì)菌檢測陽性48 例(67.6%)作為mNGS 陽性組, 陰性23 例(32.4%)作為mNGS 陰性組。mNGS陽性組的月齡顯著小于陰性組, WBC、PLT 顯著高于mNGS 陰性組, 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組性別、Hb、LDH、PCT、抗生素使用率、氧合指數(shù)、先天性心臟病發(fā)生率、機(jī)械通氣率、PICU 住院天數(shù)、治愈出院率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 mNGS 細(xì)菌檢測陽性的影響因素分析［n, M(P25, P75), ±s］

表3 mNGS 細(xì)菌檢測陽性的影響因素分析［n, M(P25, P75), ±s］

注：與mNGS 陰性組比較, aP<0.05；1 mm Hg=0.133 kPa

指標(biāo) mNGS 陽性組(n=48) mNGS 陰性組(n=23)性別(男/女) 29/19 14/9月齡(個月) 5.5(2.3, 18.8)a 18.0(3.0, 54.0)WBC(×109/L) 13.2(8.5, 18.6)a 9.6(5.7, 13.8)Hb(g/L) 107.6±17.4 110.5±24.3 PLT(×109/L) 466.2±258.7a 295.7±192.1 LDH(U/L) 364.2(309.6, 441.9) 413.9(338.6, 537.0)PCT(μg/L) 1.0(0.3, 3.6) 0.9(0.3, 6.7)抗生素使用 36(75.0) 15(65.2)氧合指數(shù)(mm Hg) 272.4±89.7 286.3±117.6先天性心臟病 20(41.7) 7(30.4)機(jī)械通氣 44(91.7) 18(78.3)PICU 住院天數(shù)(d) 9.0(6.0, 12.0) 8.0(6.0, 13.0)治愈出院 42(87.5) 20(87.0)

2.4 TPD 細(xì)菌檢測陽性的影響因素分析 71 例患兒經(jīng)TPD 細(xì)菌檢測陽性27 例(38.0%)作為TPD 陽性組, 陰性44 例(62.0%)作為TPD 陰性組。TPD 陽性組的抗生素使用率55.6%(15/27)顯著低于TPD 陰性組的81.8%(36/44), WBC 顯著高于TPD 陰性組, 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組性別、月齡、Hb、PLT、LDH、PCT、氧合指數(shù)、先天性心臟病發(fā)生率、機(jī)械通氣率、PICU 住院天數(shù)、治愈出院率并比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 TPD 細(xì)菌檢測陽性的影響因素分析［n, M(P25, P75), ±s］

表4 TPD 細(xì)菌檢測陽性的影響因素分析［n, M(P25, P75), ±s］

注：與TPD 陰性組比較, aP<0.05

指標(biāo) TPD 陽性組(n=27) TPD 陰性組(n=44)性別(男/女) 16/11 27/17月齡(個月) 6.0(2.0, 20.0) 9.0(3.0, 31.8)WBC(×109/L) 13.5(10.8, 22.5)a 10.0(6.1, 14.6)Hb(g/L) 105.8±17.1 110.3±21.3 PLT(×109/L) 414.0±206.5 405.4±275.0 LDH(U/L) 386.9(330.0, 447.4) 347.5(309.2, 471.6)PCT(μg/L) 1.3(0.4, 3.6) 0.7(0.3, 5.0)抗生素使用 15(55.6)a 36(81.8)氧合指數(shù)(mm Hg) 282.1±98.2 274.0±100.6先天性心臟病 9(33.3) 18(40.9)機(jī)械通氣 26(96.3) 36(81.8)PICU 住院天數(shù)(d) 10.0(5.0, 12.0) 8.0(7.0, 13.0)治愈出院 22(81.5) 40(90.9)

3 討論

肺炎是兒童死亡的主要原因之一［7］, 隨著抗感染藥物、免疫抑制劑、生物制劑的廣泛使用, 合并免疫缺陷的患兒生存率不斷增加, 機(jī)會致病菌的侵入使得感染病原體的種類也在發(fā)生相應(yīng)改變。與其他傳染病一樣, 預(yù)后與及時充分的應(yīng)用初始抗生素治療有關(guān)。兒童免疫功能低下、氣道狹短、黏膜屏障發(fā)育不完善極易患呼吸道感染, 但病原體沒有明確識別時往往很難進(jìn)行針對性用藥, 病情短時間惡化, 會導(dǎo)致呼吸衰竭、嚴(yán)重膿毒癥、多器官功能衰竭等嚴(yán)重后果, 甚至死亡［8］。因此, 快速、準(zhǔn)確識別病原微生物成為兒童重癥社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)精準(zhǔn)抗感染治療的關(guān)鍵, 可顯著改善住院患兒最終預(yù)后［9］。

本研究中mNGS 對于致病菌的診斷效能明顯高于TPD, Kappa 檢驗提示兩者一致性較差, 提示mNGS 可以作為TPD 的補(bǔ)充, 但不能相互取代。細(xì)菌檢測方面, 本研究mNGS 細(xì)菌檢測陽性率顯著高于TPD(67.6%VS38.0%), 與李荷楠等［10］研究結(jié)果相近,感染細(xì)菌種類及耐藥性有較強(qiáng)的地域性［11］, mNGS 未能提供準(zhǔn)確耐藥性報告, 需依據(jù)當(dāng)?shù)夭煌≡w耐藥性水平進(jìn)行臨床調(diào)整用藥。本院重癥肺炎患兒以肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌為主要致病菌。值得注意的是, 對比傳統(tǒng)培養(yǎng)法, mNGS 對厭氧菌的檢測具有顯著優(yōu)勢, 3 例患兒檢出放線菌, 此類病菌常定植于人的口腔黏膜、鼻咽、扁桃體等部位, 肺部感染少見, 當(dāng)患兒免疫力低下時可機(jī)會性感染人體各個器官部位。肺放線菌病的臨床特征無典型表現(xiàn), 主要表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、呼吸困難等非特異性呼吸道癥狀, 極易誤診, 即使通過mNGS 已檢出放線菌核酸序列, 但肺部影像未見“空洞-懸浮氣泡征”等特征表現(xiàn), 同時缺乏手術(shù)確診依據(jù), 以常規(guī)抗感染治療后順利出院, 因此均未診斷肺放線菌病, 但其中1 例患兒出院后癥狀復(fù)發(fā), 多次反復(fù)住院, 最終考慮肺放線菌病,開始長期用藥, 可見當(dāng)臨床疑似肺放線菌病時可完善厭氧環(huán)境下培養(yǎng)并延長培養(yǎng)周期, 必要時采用纖維支氣管鏡下行組織病理活檢明確診斷, 以免漏診。本次常規(guī)細(xì)菌檢測主要為培養(yǎng)法, 陽性率低, 培養(yǎng)時間長達(dá)3～5 d, 相比本院mNGS 平均54 h 的報告時間, 明顯偏長, 且檢出病原體種類有限［12］, 如2 例百日咳桿菌、1 例惠普爾養(yǎng)障體均由mNGS 檢出。但隨著分子微生物學(xué)在下呼吸道細(xì)菌感染中的應(yīng)用越來越廣泛［13］, 常見細(xì)菌, 如肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌等, PCR 檢測逐漸興起, 對病原體的檢出起著重要的作用。既往研究表明, 入院前72 h 接受抗生素治療的患兒, PCR 檢測細(xì)菌病原體陽性率顯著高于培養(yǎng)法(78%VS32%), 且抗生素使用對PCR 檢出率的影響明顯小于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法。mNGS 為核酸測序, 同樣受微生物活性及抗生素使用的影響較小［14-18］。本研究中, mNGS 陽性組的抗生素使用率(75.0%)與mNGS 陰性組(65.2%)比較, 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。但基于mNGS 無偏倚和高度敏感的特點, 檢測報告中可能會出現(xiàn)假陽性結(jié)果, 且難以區(qū)分下呼吸道病原體或定植菌, 如本研究中就有1 例患兒檢出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群, 檢出序列數(shù)為8, 但影像學(xué)、結(jié)核菌素試驗(PPD)、結(jié)核分枝桿菌核酸等檢測均不滿足該診斷, 因此考慮假陽性, 并予以排除。對于有菌部位的樣本臨床醫(yī)生需多方驗證, 將病原體與正常微生物和環(huán)境污染物區(qū)予以區(qū)分, 查閱參考既往文獻(xiàn)中相應(yīng)病原體的致病報告, 另可采用PCR 技術(shù)對mNGS 檢出病原進(jìn)行復(fù)核［19-23］, 而未能正確解讀報告將會導(dǎo)致誤診, 延誤患兒病情［24,25］。

綜上所述, mNGS 是未來危重癥感染患兒精準(zhǔn)診療的發(fā)展方向, 可顯著提升兒童重癥肺炎病原體檢出率, 與TPD 互為補(bǔ)充, 是精準(zhǔn)治療及避免抗生素廣覆蓋使用的關(guān)鍵, 對臨床合理用藥有重要指導(dǎo)作用, 做到早期識別, 早期干預(yù), 進(jìn)而改善患兒預(yù)后。