薛銳　陳杰　付玉飛等

關鍵詞 球孢白僵菌；紅棕象甲；昆蟲病原真菌；生物學特性；毒力

中圖分類號：S 476.12 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022417

紅棕象甲Rhynchophorus ferrugineus Oliver屬鞘翅目Coleoptera象甲科Curculionidae棕櫚象屬Rhynchophorus，別名銹色棕櫚象、椰子隱喙象、椰子甲蟲等，于2005年被國家林業(yè)局列入林業(yè)檢疫性有害生物名錄[1]。紅棕象甲起源于亞洲南部及西太平洋上美拉尼西亞群島[2]，于20世紀80年代通過苗木調運傳人地中海沿岸、大洋洲和拉丁美洲等40余個國家和地區(qū)，國內在海南、廣東、福建、云南等長江以南地區(qū)發(fā)生為害[3-4]。紅棕象甲寄主包括加納利海棗、椰子、檳榔、大王棕、霸王棕、油棕和美麗針葵等30余種棕櫚科植物[5]。紅棕象甲成蟲在寄主植物葉柄基部的傷痕、裂口處產卵，卵孵化后，幼蟲首先蛀人幼嫩的葉柄基部，后蛀人莖干內，形成隧道并在隧道內留下植物纖維和排泄物，其取食幼嫩組織，破壞植株生長點最終導致寄主死亡[6]。因其隱蔽取食特點及生活習性，防控難度大?，F(xiàn)主要應用化學手段對其進行防治，但易造成環(huán)境污染并可能導致人畜中毒等問題。目前國內采用生物防治手段防治紅棕象甲的研究主要集中于金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae、黏質沙雷氏菌Serratia marcescens、淡紫擬青霉Paecilomyces lilacinus及昆蟲病原線蟲[7-9]。國內尚未見有自然侵染紅棕象甲的白僵菌的相關研究報道。

白僵菌Beauveria是一類常見的昆蟲病原真菌，因其寄主范圍廣、易于培養(yǎng)、對環(huán)境友好等特點，具有很強的開發(fā)潛力[10-12]。自1956年我國首次報道關于白僵菌防治甘薯象甲Cylas formzcarzus的研究后，對此方向的研究愈發(fā)深入，白僵菌現(xiàn)已廣泛被應用于防治松墨天牛Monochamus alternatus、西花薊馬Frankliniella occidentalis、亞洲玉米螟Os-trinia furnacalis、草地貪夜蛾Spodoptera frugi-perda等害蟲[13-17]。近年來，我國利用昆蟲病原真菌防治象甲科類害蟲的報道逐年增加。朱曉敏等[18]發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌Beauveria bassiana與苦參堿復配后對稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus表現(xiàn)出加成以及增效作用；張強等[19]發(fā)現(xiàn)田間施用250億孢子/g白僵菌可濕性粉劑對稻水象甲的防治效果可達65%以上；陳建軍等[20]利用400億孢子/g白僵菌可濕性粉劑對稻水象甲成蟲防治效果理想，施藥后7d防治效果高于10%醚菊酯懸浮劑以及200g/L氯蟲苯甲酰胺懸浮劑。由于寄主種類不同以及外界環(huán)境的多樣性，不同白僵菌在形態(tài)特征及致病力方面存在差異[21]，為白僵菌的分類鑒定帶來了難度。目前，將形態(tài)學特征和核酸序列分析相結合已成功用于白僵菌[22-23]和綠僵菌[24-26]的分類鑒定。

本研究自昆明市盤龍區(qū)云南農業(yè)大學采集的罹病紅棕象甲幼蟲上分離純化獲得1株病原真菌，采用形態(tài)學特征及ITS-rDNA序列對該菌株進行鑒定，同時測定了該菌株的生物學特性以及對紅棕象甲不同齡期幼蟲的致病力，旨在為生物防治紅棕象甲提供白僵菌生防藥劑的備選菌株。

1材料與方法

1.1菌株培養(yǎng)與分離純化

將采自云南省昆明市云南農業(yè)大學（25°07′N，102°44′E，海拔1950 m）校園內棕櫚樹上的罹病紅棕象甲幼蟲保濕培養(yǎng)，待蟲體表面出現(xiàn)菌絲或分生孢子后，在超凈工作臺內用接種針挑取少量分生孢子，采用點接法接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上[26-27]，置于（25±1）℃，相對濕度（75±5）%，L∥D=12h∥12h的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)獲得菌株。菌株經單孢純化后命名為KMND202111，轉入PDA斜面培養(yǎng)基生長5d后置于40C冰箱內保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯塊200 g煮汁過濾，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000mL[27]。馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）：葡萄糖替換為等量蔗糖，其他同PDA[27]。薩氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDAY）：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉10g，瓊脂20 g，蒸餾水1000mL[27]。薩氏麥芽糖酵母培養(yǎng)基（ SMAY）：葡萄糖替換為等量麥芽糖，其他同SDAY[27]。

1.3菌株鑒定

1.3.1形態(tài)鑒定

將菌株分生孢子點接于PDA培養(yǎng)基（直徑90 mm）中央，在（25±1）℃，相對濕度（75±5）%，L∥D=12h∥12h的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每日觀察菌落形態(tài)及顏色。接種后5d，挑取新鮮菌絲于滅菌載玻片上，在顯微鏡下觀察分生孢子梗形態(tài)特征。7d后挑取分生孢子制作玻片每組隨機觀測20個分生孢子的形狀與大小，設置5次重復。

1.3.2分子生物學鑒定

用1mL無菌槍頭刮取菌株KMND202111長勢良好的菌絲體，置于無菌研缽中，用液氮快速研磨成粉末，轉入1.5 mL離心管中，采用改良的CTAB法[28]并稍作修改（本試驗將65℃恒溫水浴時間由1h替換為30min，將TE緩沖液替換為ddHO，其他步驟不做更改）提取DNA。以菌株基因組DNA為模板，采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAG-GTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCT-TATTGATATGC-3′）擴增其rDNA-ITS-ITS列[29]。PCR反應體系為25μL，其中ITS1和ITS4各1μL，PCR MasterMix 12.5μL，模板DNA 1μL，超純水9.5μL。PCR反應條件：95℃預變性3 min；940C變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察擴增結果[30]。擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

去除所得序列兩端質量不好的堿基，將優(yōu)化后的序列提交至NCBI網站進行BLAST比對，下載與目標序列具有高同源性的序列，使用MEGA X軟件通過鄰接法（neighbour-joining method，NJ），運行1000次bootstrap驗證，構建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹[31]。

1.4分離菌株的生物學特性測定

1.4.1培養(yǎng)基對菌株生長和產孢的影響

分別測定菌株在SDAY、SMAY、PDA及PSA培養(yǎng)基上的生長和產孢情況。采用點接法將分生孢子接種于上述培養(yǎng)基平板中央，置于25℃，光周期L∥D=0h∥24h培養(yǎng)箱內（因采集到的罹病紅棕象甲幼蟲處于預蛹階段，因此將初始光周期設定為全黑暗），定時觀察并記錄菌落色澤、形態(tài)及產孢時間等。培養(yǎng)至第12天，采用十字交叉法測量菌落直徑，并計算菌落生長速率。用滅菌打孔器（直徑10 mm）自菌落中心點至邊緣距離的1／2處打取菌餅，每處理打取3個菌餅，置于含有20 mL無菌的0.05% Tween-80溶液的三角瓶中，磁力攪拌10min獲得孢子懸浮液，用血球計數板測定孢子濃度，并計算菌落單位面積的產孢量[32]。每處理重復5次。

1.4.2光周期對菌株生長和產孢的影響

將菌株分生孢子接種于1.4.1選出的最佳培養(yǎng)基上，置于25℃，光周期分別為L∥D=24h∥0h、L∥D=12h∥12h、L∥D=0h∥24h條件下培養(yǎng)12d，測定菌落直徑，計算生長速率及產孢量。每處理重復5次。

1.4.3溫度對菌株生長和產孢的影響

采用1.4.1和1.4.2篩選出的適宜培養(yǎng)基及光周期條件，溫度分別設置為20、25、30℃，培養(yǎng)12 d后測定菌落直徑。按1.4.1方法測定菌落生長速率及產孢量。每處理重復5次。

1.5分離菌株的致病力測定

采用浸漬法[33]測定菌株致病力。將紅棕象甲3齡及6齡幼蟲在濃度為108個/mL的孢子懸浮液中浸漬15s后挑出，用滅菌濾紙吸干蟲體表面多余水分后移至皿底墊有濕潤濾紙片的培養(yǎng)皿（直徑20 cm）內單頭飼養(yǎng)，每日更換新鮮甘蔗供其取食，以0.05% Tween-80浸漬為對照。將處理后的幼蟲置于溫度（25±1）℃，相對濕度（75±5）%，光周期L∥D=0h∥24h的人工氣候箱中飼養(yǎng)。每處理設置3個重復，每重復24頭幼蟲，接種后每天定時觀察，連續(xù)觀察14d，并記錄幼蟲死亡數量，計算累計死亡率及校正死亡率。對死亡后的幼蟲進行單頭保濕培養(yǎng)觀察，待死亡蟲體表面長出白色菌絲或白色分生孢子時則視為被白僵菌侵染致死。

1.6數據分析

用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0對菌落直徑及單位面積產孢量間的差異顯著性進行LSD（least significantdifference）檢驗，采用Probit方法計算致死中時（LT）。利用Origin 2020繪圖。

菌落直徑（mm）=（菌落橫徑+菌落縱徑）/2；

菌落生長速率（mm/d）=平均菌落直徑／培養(yǎng)天數；

菌落單位面積產孢量（個/mm）=平均每小格孢子數×400×104×稀釋倍數／菌餅面積；

累計死亡率=（處理組累計死亡總蟲數／處理總蟲數）×100%；

校正累計死亡率=（處理組累計死亡率－對照組累計死亡率）／（1－對照死亡率）×100%。

2結果與分析

2.1菌株KMND202111的形態(tài)特征及分子生物學鑒定

菌株KMND202111在培養(yǎng)基上生長情況如圖1c～f。培養(yǎng)第3天，菌落平展，邊緣整齊呈白色絨毛狀，呈擴環(huán)狀生長；第5天開始產孢，菌落變?yōu)榈S色，中間略凸起，孢子層呈粉狀，長勢均勻，菌落背面淡黃色并出現(xiàn)褶皺。在光學顯微鏡下，分生孢子無色、光滑、圓球形，少數卵圓形，直徑2. 1～2.4μm。營養(yǎng)菌絲細長無色；分生孢子梗在頂部軸式產孢，形成穗狀產孢結構。

使用PCR擴增分離菌株rDNA-ITS序列片段，測序結果顯示擴增片段為543bp，去除兩端低質量序列后在GenBank數據庫中進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)目的菌株ITS序列與已知球孢白僵菌對應序列的最高相似性可達到99.44%，選取相關序列，使用MEGA 11.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），其中KMND202111菌株與Beauveria bassiana CCTu0017（KM249041.1）和Beauveria bassiana KY11081（ON479331.1）處于進化樹最小分支，親緣關系最近，說明該菌株與NCBI數據庫中球孢白僵菌具有高度相似性。綜合形態(tài)特征鑒定和ITS序列相似性分析，確定該菌株為球孢白僵菌。

2.2不同培養(yǎng)條件對菌株KMND202111生長的影響

由圖3a可知，球孢白僵菌菌株KMND202111在供試培養(yǎng)基上均可生長，但生長至第12天時菌落直徑及生長速率均存在顯著差異（菌落直徑：F=6.493，P<0.05；生長速率：F=4.312，P<0.05）。菌株在PDA及SMAY培養(yǎng)基上生長最快，第12天時菌落直徑分別為50.94mm和49.23 mm；菌落生長速率分別為4.24mm/d和4.10mm/d，顯著高于在PSA（3.75mm/d）和SDAY（3.97mm/d）培養(yǎng)基上的生長速率。

球孢白僵菌菌株KMND202111在24h連續(xù)黑暗、12h光暗交替、24h連續(xù)光照條件下均可生長（圖3b），生長至第12天各處理間菌落直徑及生長速率未見顯著差異（菌落直徑：F=1.053，P>0.05；生長速率：F=1.144，P>0.05）。

3個溫度下球孢白僵菌菌株KMND202111生長12 d的菌落直徑以及生長速率存在顯著差異（菌落直徑：F=1701. 135，P<0. 05；生長速率：F=799.51，P<0.05）。在20、25℃和30℃條件下，菌落生長速率依次為2.02、4.06、4.67mm/d，其中30℃條件下生長最快，第12天菌落直徑為56.00mm，顯著高于其余處理（圖3c）。

2.3不同培養(yǎng)條件對菌株株KMND202111產孢量的影響

球孢白僵菌KMND202111在不同培養(yǎng)基上單位面積產孢量存在極顯著差異（F=64.463，P<0.01）。其中在PDA培養(yǎng)基上的產孢量最高，達到6.38×10個／mm，極顯著高于其他處理；在SDAY培養(yǎng)基上產孢量為3.20×10個/mm，極顯著低于其余處理（圖4a）。綜上所述，球孢白僵菌KMND202111菌株適宜在PDA培養(yǎng)基上生長。

球孢白僵菌KMND202111于24 h連續(xù)黑暗、12 h光暗交替、24 h連續(xù)光照條件下培養(yǎng)12 d，產孢量沒有顯著差異（F=0.383，P>0.05），由此表明，該菌株對光周期的變化不敏感（圖4b）。

3個培養(yǎng)溫度下球孢白僵菌KMND202111的產孢量存在極顯著差異（F=428.20，P<0.01），在30℃下培養(yǎng)至第12天菌落單位面積產孢量為9.09×10個／mm，極顯著高于其他溫度處理；在20 0C下，產孢量為2.47×10個／mm，極顯著低于其余處理（圖4c）。

2.4菌株KMND202111對紅棕象甲幼蟲的毒力

毒力測定結果表明，球孢白僵菌KMND202111對紅棕象甲具有侵染作用（圖1a～b）。濃度10個／mL的孢子懸浮液接種處理后第3天，3齡幼蟲累計死亡率明顯大于對照；接種處理后第4天，6齡幼蟲累計死亡率明顯大于對照。將死亡蟲體置于光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，第3天時死亡蟲體的首末端開始有菌絲長出，第6天時幼蟲蟲體長滿菌絲。第10天，球孢白僵菌KMND202111菌株對紅棕象甲3齡幼蟲的累計校正死亡率達到100%（圖5a），毒力回歸方程為y=4.12x－2.67（R=0.917），LT為4.88d，95%置信區(qū)間為3.611～5.793 d；第10天，球孢白僵菌KMND202111對紅棕象甲6齡幼蟲的累計校正死亡率為76.4%，第14天達到90.3%（圖5b），毒力回歸方程為y=3.07x=2.55（R=0.902），LT為7.64 d，95%置信區(qū)間為5.903～8.446d。

3結論與討論

紅棕象甲是一種重要的園林植物害蟲，國內外許多學者十分關注昆蟲病原體例如球孢白僵菌[34]、金龜子綠僵菌[35]、病原線蟲[36]以及蘇云金芽胞桿菌[37]等對其毒力作用及防控應用。國內對于該蟲防治主要集中于金龜子綠僵菌[26]、淡紫擬青霉[3]及黏質沙雷氏菌[3]的利用，尚未見侵染紅棕象甲的白僵菌相關研究報道。本研究從自然罹病紅棕象甲幼蟲上分離獲得1株病原真菌KMND202111，根據該菌株形態(tài)特征以及ITS序列比對分析，鑒定該菌株為球孢白僵菌。

球孢白僵菌是目前廣泛應用的殺蟲真菌，其不同菌株的生物學特性及致病力隨其寄主的不同而存在差異。黃鵬等[38]發(fā)現(xiàn)，分離自南洋臀紋粉蚧Pl-anococcus lilacinus和石蒜綿粉蚧Phenacoccus sola-ni的球孢白僵菌BB-T02在28℃，光周期L∥D=8h∥16h條件下生長發(fā)育良好。溫紹海等[22]發(fā)現(xiàn)，分離自蠼螋成蟲的球孢白僵菌HNC-1及YY-1在25℃下生長速率、產孢量以及萌發(fā)率最高；陳春艷等[39]發(fā)現(xiàn)，分離自栗實象Curculio davidi的球孢白僵菌在25～26℃，光周期為L∥D=14 h∥10 h條件下生長速率以及產孢量最佳；張磊等[40]研究發(fā)現(xiàn)，分離自大豆高隆象Ergania doriae yunnanus的球孢白僵菌BEdyl菌株在26℃下生長速率最高，在22℃下產孢量最大；王定鋒等[41]研究發(fā)現(xiàn)，分離自茶麗紋象甲Myllocerinus aurolineatus的布氏白僵菌Beauveria brongniartii Bbr1552在蛋白胨馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PPDA）上25℃時生長發(fā)育及產孢量最高。本研究發(fā)現(xiàn)，分離自紅棕象甲幼蟲的球孢白僵菌KMND202111菌株適宜生長的溫度為30℃，而光周期對其生長發(fā)育無明顯影響。由此表明，分離自紅棕象甲幼蟲的球孢白僵菌KMND202111具有較強的耐熱能力，適合在30℃左右環(huán)境中使用。

本研究發(fā)現(xiàn)菌株KMND202111對紅棕象甲3齡及6齡幼蟲有較強毒力，其LT分別為4.88 d和7.64 d。相較于國內外其他用于防治紅棕象甲幼蟲的生防真菌，該菌株毒力更強，致死中時更短[42-45]。球孢白僵菌對寄主昆蟲的侵染是附著胞產生的機械壓力以及分泌酶共同作用的結果[46]，分生孢子附著于蟲體壁后誘導分泌胞外蛋白酶，使其可以牢固附著于寄主昆蟲蟲體表面[47]，并通過蛋白質酶、幾丁質酶、脂酶以及淀粉酶等進一步降解昆蟲表皮完成侵染。不同昆蟲病原真菌的致病力與某些酶（如蛋白質酶和幾丁質酶）的含量及活性有關[48-49]。據報道，黃粉蟲Tenebrio molitor、褐飛虱Nilaparvata lugens、馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata不同發(fā)育階段對蟲生真菌敏感性存在差異[50-52]，李浩等[53]和Yu等[54-55]研究認為，老熟幼蟲體內的解毒酶更容易被誘導，且活性較高，隨著昆蟲逐漸老熟，其表皮結構也更為完善，因而對生防真菌的敏感性降低。本研究分離的菌株對棕櫚象甲幼蟲表現(xiàn)出較強的致病力，但其侵染致病作用是否與蛋白質酶和幾丁質酶含量與活性相關還需要深入探究。