曹惠鵑,劉 敏,張曉東,孫瑩杰*,刁玉剛

0 引言

體外循環(huán)(Cardiopulmonary bypass,CPB)誘發(fā)的肺損傷是心臟手術(shù)的常見并發(fā)癥之一,嚴(yán)重影響患者預(yù)后。CPB過程中,全身炎癥反應(yīng)和缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激對(duì)肺組織造成損傷,可導(dǎo)致肺水腫、肺不張、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)等嚴(yán)重疾病[1-2]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine,NAC)具有抗炎、抗氧化作用,可減輕感染性休克小鼠肺損傷的嚴(yán)重程度[3],降低CPB下行心臟瓣膜置換術(shù)患者血漿肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A水平,并改善呼吸功能參數(shù)[4]。因此,本研究將NAC用于CPB大鼠,旨在探討其對(duì)CPB 所致肺損傷的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠24只,體重350～450 g,12～16周齡,由北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組(control組)、CPB組、NAC+CPB組,每組8只。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處置均符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理號(hào):2014076)。

1.2 模型建立 大鼠飼養(yǎng)環(huán)境:安靜,空氣清新,溫度18～25 ℃,相對(duì)濕度55%～60%,12 h光暗循環(huán)。每天更換墊料,大鼠可自由進(jìn)食和飲水。術(shù)前禁食6 h,不禁飲。大鼠稱重后,10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉,大鼠翻轉(zhuǎn)反射消失后,將其固定于鼠板,行氣管插管后,連接小動(dòng)物呼吸機(jī),設(shè)定呼吸參數(shù):氧體積分?jǐn)?shù)1.0,潮氣量3 ml/100 g,呼吸頻率60次/min,吸呼比1.0∶1.5,氣道峰壓9 cmH2O。穿刺部位備皮、消毒后,右股靜脈穿刺置管,經(jīng)微量輸液泵補(bǔ)液;尾動(dòng)脈穿刺置管后接壓力傳感器,行有創(chuàng)動(dòng)脈血壓監(jiān)測(cè);右頸靜脈穿刺,將自制的帶側(cè)孔的18G導(dǎo)管置于右心房;22G套管針左股動(dòng)脈置管,用于CPB過程中血液回輸,進(jìn)行預(yù)充和血?dú)夤芾韀5]。初始轉(zhuǎn)流量為25～30 ml/(kg·min),逐漸增加至100～150 ml/(kg·min),將儲(chǔ)血器液體平面控制在3～4 ml。轉(zhuǎn)流開始將氧氣與膜式氧合器相連,關(guān)閉呼吸機(jī)。轉(zhuǎn)流期間,維持平均動(dòng)脈壓>60 mmHg,pH 7.35～7.45,動(dòng)脈二氧化碳分壓35～45 mmHg,堿剩余-3～3 mmol/L,紅細(xì)胞壓積>25%。轉(zhuǎn)流時(shí)間達(dá)到1 h后,逐漸減小轉(zhuǎn)流量至停止,開啟小動(dòng)物呼吸機(jī),恢復(fù)機(jī)械通氣。實(shí)驗(yàn)過程中,維持大鼠體溫在35.5～36.5 ℃。轉(zhuǎn)流結(jié)束2 h后,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生命體征平穩(wěn)視為模型建立成功。Control組只進(jìn)行動(dòng)靜脈置管不進(jìn)行CPB,CPB組、NAC+CPB組置管并進(jìn)行CPB 1 h,轉(zhuǎn)流結(jié)束后觀察2 h。NAC+CPB組在預(yù)充液中加入NAC 100 mg/kg,然后以20 mg/(kg·min)持續(xù)泵注直至轉(zhuǎn)流停止。CPB組在預(yù)充液中加入等容量的生理鹽水,轉(zhuǎn)流期間泵注等容量生理鹽水。

1.3 觀察指標(biāo) 建模成功后,取大鼠股動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治?計(jì)算氧合指數(shù)(Oxygenation index,OI)和呼吸指數(shù)(Respiratory index,RI)。麻醉狀態(tài)下放血處死大鼠,開胸取左上肺葉進(jìn)行濕/干重比值測(cè)定;左下肺葉經(jīng)甲醛固定,梯度乙醇脫水,石蠟包埋,連續(xù)切片,HE染色,在光鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。參照Kim等[6]的標(biāo)準(zhǔn),對(duì)肺組織損傷程度進(jìn)行評(píng)分。右肺置于液氮中,采用ELISA法檢測(cè)肺組織腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)水平,試劑盒均購自美國(guó)R&D公司。比色法測(cè)定肺組織丙二醛 (Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的水平,試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。蛋白免疫印跡法檢測(cè)肺組織緊密連接蛋白claudin-4的表達(dá)情況,一抗購自美國(guó)Abcam公司,二抗工作液購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理學(xué)情況 光鏡下,control組肺組織結(jié)構(gòu)清晰完整,未見明顯異常,而CPB組和NAC+CPB組肺泡、肺泡腔、肺泡間隔均有不同程度的損傷。CPB組表現(xiàn)為部分肺泡壁斷裂、肺泡腔塌陷,肺泡腔內(nèi)可見炎癥細(xì)胞、紅細(xì)胞和水腫液滲出。NAC+CPB組表現(xiàn)為肺泡間隔略增寬,肺泡毛細(xì)血管略擴(kuò)張,肺泡腔內(nèi)有少許炎癥細(xì)胞及紅細(xì)胞滲出。與control組比較,CPB組和NAC+CPB組肺泡間隔變厚;與CPB組比較,NAC+CPB組肺泡間隔變薄,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1和表1。

表1 各組大鼠肺泡間隔厚度、肺損傷評(píng)分、濕/干重比值及肺功能指標(biāo)比較(n=8)

2.2 各組大鼠肺損傷評(píng)分、濕/干重比值及肺功能指標(biāo)比較 與Control組比較,CPB組、NAC+CPB組的肺損傷評(píng)分、濕/干重比值、RI增高;與CPB組比較,NAC+CPB組上述指標(biāo)顯著降低,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Control組比較,CPB組、NAC+CPB組OI顯著降低;與CPB組比較,NAC+CPB組OI顯著升高,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3 各組大鼠肺組織MDA、TNF-α、IL-6、SOD水平比較 與Control組比較,CPB組、NAC+CPB組肺組織TNF-α、IL-6及MDA水平顯著升高;與CPB組比較,NAC+CPB組上述指標(biāo)顯著降低,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Control組比較,CPB組、NAC+CPB組SOD水平顯著降低;與CPB組比較,NAC+CPB組SOD水平顯著升高,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肺組織MDA、TNF-α、IL-6、SOD水平比較(n=8)

2.4 各組肺組織claudin-4蛋白表達(dá)情況比較 與Control組比較,CPB組、NAC+CPB組大鼠肺組織claudin-4蛋白的表達(dá)均下調(diào),與CPB組比較,NAC+CPB組肺組織claudin-4蛋白的表達(dá)上調(diào),且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組肺組織claudin-4蛋白表達(dá)情況比較(n=8)注:*與Control組比較,P<0.05;#與CPB組比較,P<0.05

3 討論

CPB可致多個(gè)器官損傷,肺損傷是常見的并發(fā)癥之一。血液與CPB管路接觸后,血細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及補(bǔ)體被激活,釋放出多種炎癥因子,誘發(fā)肺損傷;而缺血再灌注可破壞肺血管內(nèi)皮細(xì)胞,造成肺水腫,進(jìn)一步加重肺損傷[5,7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,腹腔注射一定劑量的NAC,可在一定程度上降低脂多糖導(dǎo)致的感染性休克小鼠的肺組織炎性因子水平和肺組織病理學(xué)評(píng)分[8]。課題組的前期臨床研究發(fā)現(xiàn),在CPB前及CPB過程中應(yīng)用一定劑量的NAC,可降低風(fēng)濕性心臟病患者CPB下行心內(nèi)直視術(shù)的血漿肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A水平[4],改善呼吸指數(shù)、氧合指數(shù)和氣道阻力等呼吸功能參數(shù),但NAC對(duì)CPB致肺損傷的具體保護(hù)作用及機(jī)制尚不明確。

目前,CPB 誘發(fā)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)被認(rèn)為是CPB所致肺損傷的主要原因,而TNF-α、IL-6和IL-8可導(dǎo)致多臟器功能障礙且與患者預(yù)后密切相關(guān)[7,9]。有研究表明,在CPB過程中經(jīng)肺動(dòng)脈灌注TNF-α抗體,可降低兔肺組織TNF-α水平,改善氧合指數(shù)及減輕肺泡結(jié)構(gòu)的損傷程度。此外,CPB過程中肺組織缺血,CPB結(jié)束后肺組織恢復(fù)灌注所致的再灌注損傷,以及CPB時(shí)肺組織的高氧耗狀態(tài)[10],也可導(dǎo)致肺損傷。本研究發(fā)現(xiàn),CPB后,肺組織發(fā)生了明顯的損傷性改變,存在明顯的氧化應(yīng)激;而在CPB前及CPB中靜脈應(yīng)用一定劑量的NAC,可以降低肺組織MDA水平,上調(diào)肺組織SOD抗氧化酶的活性,顯著減輕肺損傷。通過測(cè)量MDA、SOD及肺損傷評(píng)分評(píng)價(jià)損傷的情況,發(fā)現(xiàn)NAC通過清除氧自由基、過氧化氫等物質(zhì)發(fā)揮保護(hù)作用,降低肺損傷評(píng)分。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在CPB前和CPB過程中應(yīng)用一定劑量的NAC,可顯著降低大鼠肺組織中TNF-α和IL-6水平,提示NAC除抗氧化應(yīng)激作用外,還在一定程度上降低CPB所誘發(fā)的肺組織炎癥反應(yīng)。臨床研究表明,NAC可降低體外循環(huán)下?lián)Q瓣患者血漿炎性因子水平[4],而本研究進(jìn)一步在肺組織水平證明NAC的抗炎作用和肺保護(hù)作用。

緊密連接是調(diào)節(jié)細(xì)胞旁屏障對(duì)水、小分子和離子通透性的頂端連接復(fù)合體成分,而調(diào)節(jié)細(xì)胞旁通透性的主要決定因素是claudin家族跨膜蛋白。緊密連接蛋白claudin形成具有不同特異性和通透性的細(xì)胞旁離子通道,組織特異性 claudin 復(fù)合物決定器官的特異性細(xì)胞旁通透性[11]。緊密連接蛋白claudin的組成和結(jié)構(gòu)也對(duì)環(huán)境應(yīng)激(如炎癥)敏感,其組成和結(jié)構(gòu)的改變會(huì)影響細(xì)胞旁屏障功能,而肺泡上皮緊密連接表達(dá)下降會(huì)影響肺泡上皮細(xì)胞旁離子通道的特異性功能,無法正常轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)和清除肺泡內(nèi)的液體,導(dǎo)致肺水腫[12-13]。本研究結(jié)果表明,CPB可誘發(fā)肺組織氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng),下調(diào)大鼠肺組織claudin-4蛋白表達(dá),導(dǎo)致肺水腫;而NAC具有抗氧化和抗炎作用,能夠改善CPB大鼠的claudin-4蛋白表達(dá)和肺水腫情況。NAC可能通過抗氧化及抗炎作用減輕緊密連接蛋白claudin的環(huán)境應(yīng)激,進(jìn)而上調(diào)緊密連接蛋白claudin的表達(dá),從而減輕肺水腫,發(fā)揮肺保護(hù)作用。

綜上所述,在CPB過程中應(yīng)用一定劑量的NAC,可減輕CPB誘發(fā)的肺損傷,其機(jī)制可能與其抗炎、抗氧化作用及上調(diào)緊密連接蛋白claudin-4的表達(dá)有關(guān)。