郭軼斌，李佳迅，吳 騁，郭 威，何 倩

1.海軍軍醫(yī)大學衛(wèi)生勤務學系軍隊衛(wèi)生統(tǒng)計學教研室（上海 200433）

2.海軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院（上海 200433）

在基礎醫(yī)學實驗研究中，研究對象以細胞、動物為主，一些實驗細胞或動物模型不僅構造困難，而且花費較大，如巴馬小型豬或恒河猴等，不僅動物本身費用較高，同時因倫理限制無法納入太多。因此，部分動物實驗的樣本量極小，如每組小于10 例[1-3]。統(tǒng)計學上為了保證一定的統(tǒng)計檢驗效率，常要求樣本例數不能過小。此外，在使用如獨立樣本t檢驗等參數檢驗方法時，還要求樣本服從正態(tài)分布和方差齊性的假設[4]。但在極小樣本的情況下，即使是不服從正態(tài)分布的樣本，在統(tǒng)計檢驗效率很低的情況下也無法拒絕H0假設（樣本服從正態(tài)分布或滿足方差齊性）。當獨立定量資料樣本不滿足正態(tài)分布或方差齊性假設時，可以使用對數據分布不敏感的非參數檢驗，對于兩組獨立定量資料，可以使用Wilcoxon秩和檢驗或Mann-WhitneyU檢驗來比較兩個樣本所代表的總體分布位置是否相同[5-6]。但這兩種方法是將樣本的原始數據編秩后再進行后續(xù)的假設檢驗，當資料服從參數檢驗的條件時，會導致樣本大量變異的信息損失，進而影響統(tǒng)計檢驗效率，增加犯Ⅱ類錯誤的概率[7]。當樣本量小于4 時，使用Wilcoxon 秩和檢驗的P值均大于0.05。Siegel 認為樣本量小于6 時，不能使用t檢驗[8]。祝國強等認為在對非正態(tài)極小樣本的定量資料進行統(tǒng)計推斷時，不適合使用t檢驗，推薦使用Wilcoxon 秩和檢驗[9]。林正大等認為在大樣本或偏離對稱性較遠的情況下，Wilcoxon 秩和檢驗更優(yōu)[10]。對于統(tǒng)計學的頻率學派來說，假設檢驗和置信區(qū)間（Confidence Interval,CI）是一對相伴相隨的概念，在同一置信度/檢驗水準下，參數的置信區(qū)間未跨過拒絕域，假設檢驗則不能拒絕H0。Bootstrap 法是一種可以用來穩(wěn)健地估計置信區(qū)間的非參數方法，其通過對原始樣本數據進行有放回抽樣得到統(tǒng)計量的經驗分布，從而估計統(tǒng)計量對應總體參數的置信區(qū)間[11]。在極小樣本時，Bootstrap 法能否達到其在大樣本中的穩(wěn)健性，以及該方法估計的置信區(qū)間的精度也值得進一步探索。

本研究采用蒙特卡洛數據模擬方法，比較兩獨立樣本t檢驗、Wilcoxon 秩和檢驗和Bootstrap 置信區(qū)間法在解決極小樣本兩獨立定量資料比較中的表現(xiàn)，以期為相關實驗性研究提供方法學參考。

1 資料與方法

1.1 模擬數據的生成

通過蒙特卡洛數據模擬方法生成模擬數據，主要有以下幾個模擬情景。樣本含量：本研究主要模擬極小樣本量下的統(tǒng)計方法表現(xiàn)性能，共模擬5 種樣本量——每組各2、3、5、10 和20。均數差：共設置5 種均數差——0、0.5、1、2 和3。從均數相同的兩總體中抽樣，兩總體均數差為0，H0成立，且均數差的置信區(qū)間包含0，認為兩樣本來自同一總體，兩組樣本均數的不同由抽樣誤差造成，當統(tǒng)計檢驗方法拒絕H0時則認為發(fā)生I類錯誤。當兩樣本均數差不為0 時，兩樣本不是來自同一樣本，若統(tǒng)計檢驗方法未能拒絕H0，則認為發(fā)生Ⅱ類錯誤。樣本分布：共設置3 種總體分布，第1 種為兩樣本均服從總體方差為12 的正態(tài)分布，總體均數根據均數差確定（其中一組為0，即第一組的總體為標準正態(tài)分布）；第2種（偏態(tài)分布一）為兩樣本服從偏度系數為1.5，峰度系數為3.0 的偏態(tài)分布；第3 種（偏態(tài)分布二）為兩樣本服從偏度系數為1.0，峰度系數為2.0 的偏態(tài)分布[12]。

對以上三個因素的不同水平進行全排列構建75 種（5 種樣本量×5 種均數差×3 種總體分布）情景，每種生成10 000 個模擬數據集。

1.2 檢驗方法

基于Bootstrap 法估計均數差的置信區(qū)間。采用Bootstrap 重抽樣技術對模擬數據集進行1 000次重抽樣構建兩樣本均數差的經驗分布。通過估計經驗分布的第2.5%和第97.5%分位數確定均數差的95%CI。當95%CI 下限大于0 或上限小于0 時，認為兩組均數差異有統(tǒng)計學意義，兩樣本對應的總體均數不同。

參數和非參數假設檢驗法。采用兩獨立樣本t檢驗和Wilcoxon 秩和檢驗對兩總體均數是否相同進行假設檢驗。與Bootstrap 法估計的95%CI相對應，假設檢驗的檢驗水準α=0.05，均為雙側檢驗。

1.3 評價標準

在均數差為0 時，若t檢驗和Wilcoxon 秩和檢驗的P值小于α，或Bootstrap 法估計的均數差95%CI 未跨過0，認為發(fā)生I 類錯誤。在均數差不為0 時，以上情形認為成功檢驗出統(tǒng)計學差異，即未發(fā)生Ⅱ類錯誤。

分別使用t檢驗、Wilcoxon秩和檢驗和Bootstrap 置信區(qū)間法對75 種情景下，每種情景的10 000 個模擬數據集進行分析。計算并比較3 種方法在不同數據情景下的I 類錯誤發(fā)生率和100%-Ⅱ類錯誤發(fā)生率（統(tǒng)計效率）。

1.4 統(tǒng)計軟件和硬件

本研究使用的統(tǒng)計軟件為R 4.1.3，數據模擬的平臺為塔式服務器，處理器型號為Intel Xeon Gold 6230，內存為384GB。

2 結果

2.1 I類錯誤

大樣本時I 類錯誤的發(fā)生與樣本量無關，其僅與檢驗水準α 有關，但根據本研究的模擬結果，t檢驗和Wilcoxon 秩和檢驗的I 類錯誤發(fā)生率均小于檢驗水準（圖1a 和圖1b）。當樣本量n=2、n=3 時，Wilcoxon 秩和檢驗的I 類錯誤發(fā)生率為0。這是由Wilcoxon 秩和檢驗方法特性造成的[8]。對于t檢驗來說，極小樣本時的I 類錯誤發(fā)生率小于檢驗水準α，尤其是當數據分布為本研究設定的兩種偏態(tài)分布時更為明顯，這可能與此種情形下不適用t檢驗有關。但Bootstrap 置信區(qū)間法的I 類錯誤發(fā)生率較高，當數據服從正態(tài)分布時，I類錯誤發(fā)生率隨著樣本量的增加而下降，當數據為偏態(tài)分布時，I 類錯誤發(fā)生率隨著樣本量的增加而上升（圖1c）。

圖1 三種方法的I類錯誤發(fā)生率（%）Figure 1.Type I error rate of three methods (%)

2.2 統(tǒng)計效率

三種總體分布下（正態(tài)分布、偏態(tài)分布一和偏態(tài)分布二）分別使用三種方法（t檢驗、Wilcoxon 秩和檢驗和Bootstrap 置信區(qū)間法）的統(tǒng)計效率分別如圖2a、圖2b 和圖2c 所示。當均數差較小時，無論使用哪種方法，統(tǒng)計效率都很低，Bootstrap 置信區(qū)間法表現(xiàn)略優(yōu)于另外兩種假設檢驗的方法；當均數差較大時，即使樣本量很小，Bootstrap 置信區(qū)間法仍有較高的統(tǒng)計效率，說明此時犯Ⅱ類錯誤的概率較低（圖2c）。

圖2 不同情形下三種方法的統(tǒng)計效率（%）Figure 2.Power of three methods in different scenarios (%)

無論數據是否服從正態(tài)分布，當樣本量極小時（n=2、n=3），t檢驗的表現(xiàn)優(yōu)于Wilcoxon 秩和檢驗。但當樣本量較大且均數差也較大時，t檢驗與Wilcoxon 秩和檢驗統(tǒng)計效率差異不大（圖2a、圖2b）。

3 結論

本研究通過數據模擬的方法，探索了采用兩獨立樣本t檢驗、Wilcoxon 秩和檢驗和Bootstrap置信區(qū)間法對極小樣本兩獨立定量資料進行統(tǒng)計推斷時統(tǒng)計效率的差異。由模擬結果可見，相較于Wilcoxon 秩和檢驗，t檢驗在樣本量極小時（n=2、n=3）仍有一定的統(tǒng)計效率，且對總體數據分布不是很敏感。當數據服從本研究設定的兩種偏態(tài)分布時，t檢驗的表現(xiàn)不差于Wilcoxon 秩和檢驗。在樣本量極小時，Bootstrap 置信區(qū)間法可以增加統(tǒng)計效率，但在兩組樣本均數差為0（即兩組樣本來自同一總體），且數據服從正態(tài)分布時，犯I 類錯誤的概率較高。

綜上，根據本模擬研究結果，當數據服從正態(tài)分布時，建議使用t檢驗對極小樣本進行統(tǒng)計推斷；當數據不服從正態(tài)分布時，建議使用Bootstrap 置信區(qū)間法對極小樣本進行統(tǒng)計推斷。由于對于極小樣本統(tǒng)計效率太低，當樣本量極小時，無論數據服從何種分布，均不建議使用Wilcoxon 秩和檢驗進行統(tǒng)計推斷。