范高福,韋夢(mèng)強(qiáng),吳 丹,方麗波,梁延波

(1.合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.上海海虹實(shí)業(yè)(集團(tuán))巢湖今辰藥業(yè)有限公司質(zhì)控科,安徽 巢湖 238000)

石榴(PunicagranatumL.) ,石榴科石榴屬植物,又名安石榴、山力葉、丹若等,具有藥食同源特性,源于中亞、東南亞地區(qū),在我國(guó)被廣泛種植,其中安徽懷遠(yuǎn)石榴作為國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品,具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功效[1]。當(dāng)前石榴產(chǎn)業(yè)主要以品種改良、產(chǎn)品深加工為主[2],特別是廢棄石榴皮再生利用備受關(guān)注,研究發(fā)現(xiàn)石榴皮功能部位中潛在安石榴苷(Punicalagin,PU)、鞣花酸(Ellagic acid,EA)、沒(méi)食子酸(Gallic acid,GA)等多酚類生物活性物質(zhì),具有抗氧化、消炎殺菌、調(diào)脂降糖及防癌等多種藥理作用[3-10]。當(dāng)前針對(duì)石榴中鞣花酸、沒(méi)食子酸或安石榴苷等單體提取物的檢測(cè)方法較多[11-12],但關(guān)于安徽主產(chǎn)區(qū)石榴皮中安石榴苷、鞣花酸、沒(méi)食子酸3種成分含量同時(shí)檢測(cè)的方法尚未見(jiàn)報(bào)道,本次實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC),對(duì)安徽本地的常見(jiàn)石榴品種的廢棄皮部位提取物安石榴苷、鞣花酸、沒(méi)食子酸3種多酚類成分建立同時(shí)檢測(cè)方法,旨在為安徽本地及全國(guó)石榴產(chǎn)區(qū)廢棄石榴皮部位進(jìn)行多酚類成分檢測(cè)提供補(bǔ)充方法。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

安徽懷遠(yuǎn)石榴購(gòu)自安徽省蚌埠市懷遠(yuǎn)王氏榴園,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院彭華勝教授鑒定為石榴科石榴屬石榴;安石榴苷對(duì)照品(純度≥98%,Sigma-Alrdich公司);鞣花酸對(duì)照品(純度≥98%,Sigma-Alrdich公司);沒(méi)食子酸對(duì)照品(純度≥98%,Sigma-Alrdich公司);Milli-Q超純水,甲醇、乙腈為色譜純;其余所需試劑均為分析純;新鮮石榴皮干粉由實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters-e2695 HPLC系統(tǒng):2998-PDA檢測(cè)器(美國(guó)沃特世公司);Mnli-Q Biocel超純水系統(tǒng)(美國(guó)密理博公司);JC-QX-3.2L型超聲波清洗器(青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司); R-1005型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);FD-1C-50冷凍干燥機(jī)(上海比朗儀器有限公司);ME104E電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);HX-0508數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇天翔儀器有限公司);SHZ-95B型實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水真空泵(上海申生儀器抽濾真空泵廠);DGG-9030A型干燥箱(北京宏展儀器有限公司)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 安石榴苷、鞣花酸和沒(méi)食子酸檢測(cè)的色譜條件

色譜柱:Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相含甲醇(A)-0.2%磷酸溶液(B)梯度洗脫(0～9 min,94% B;9～21 min,94%～85% B;21～30 min,55% B;30～40 min,55%～45% B;40～48 min,94% B),甲醇沖柱 10 min,94% B平衡 30 min。流速1.0 mL·min-1,柱溫30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)272 nm,進(jìn)樣體積10 μL。在此色譜條件下,安石榴苷、鞣花酸、沒(méi)食子酸特征峰峰型良好,無(wú)肩峰、拖尾等現(xiàn)象,其色譜圖如圖1所示。

1—沒(méi)食子酸;2—安石榴苷;3—鞣花酸。(a)對(duì)照品

1—沒(méi)食子酸;2—安石榴苷;3—鞣花酸。(c)紅酸石榴皮樣品圖1 HPLC色譜圖

2.1.2 安石榴苷、鞣花酸和沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取石榴皮提取物安石榴苷、鞣花酸、沒(méi)食子酸各對(duì)照品適量,置入容量瓶,加60%甲醇稀釋液定量,配制濃度分別為52.0 μg/mL,50.2 μg/mL,50.8 μg/mL的對(duì)照品溶液備用。

2.1.3 安石榴苷、鞣花酸和沒(méi)食子酸檢測(cè)的供試品石榴皮溶液的制備

取鮮石榴剝皮后收集,30℃干燥箱烘干粉碎處理后過(guò)篩,精密稱取石榴皮干粉0.252 0 g,移入容量瓶中,加入60%甲醇稀釋液25 mL,經(jīng)超聲(100 W,40 Hz)震蕩搖勻30 min后稱重,再用60%甲醇稀釋液補(bǔ)缺,搖勻后抽濾取濾液,并經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)精濾制得。

2.1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

利用PDA檢測(cè)器對(duì)安石榴苷、鞣花酸、沒(méi)食子酸各對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)紫外掃描,測(cè)得吸收輪廓線圖譜見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示,安石榴苷在257 nm、358 nm和388 nm處有最大吸收,鞣花酸在254 nm和359 nm處有最大吸收,沒(méi)食子酸在254 nm和359 nm處有最大吸收,未出現(xiàn)干擾峰,且分離度較好。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[13-15],最終確定272 nm作為安石榴苷、鞣花酸和沒(méi)食子酸同時(shí)檢測(cè)的波長(zhǎng)。

1—沒(méi)食子酸對(duì)照品;2—安石榴苷對(duì)照品;3—鞣花酸對(duì)照品。圖2 安石榴苷對(duì)照品、鞣花酸對(duì)照品、沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液輪廓線掃描圖

3 結(jié)果分析

3.1 安石榴苷、鞣花酸和沒(méi)食子酸檢測(cè)的方法學(xué)考察

3.1.1 線性范圍

避光環(huán)境下精密稱取安石榴苷、鞣花酸、沒(méi)食子酸各對(duì)照品干粉適量,置于棕色容量瓶中,加60%甲醇稀釋液定容至50 mL,超聲震蕩后搖勻即得對(duì)照品母液,再用60%甲醇分別稀釋得到不同質(zhì)量濃度對(duì)照品混合溶液,安石榴苷溶液(濃度分別為209.92 μg/mL,104.96 μg/mL,52.480 μg/mL,26.240 μg/mL,13.120 μg/mL)、鞣花酸溶液(濃度分別為213.20 μg/mL,106.60 μg/mL,53.300 μg/mL,26.650 μg/mL,13.325 μg/mL)和沒(méi)食子酸溶液(濃度分別為212.40 μg/mL,106.20 μg/mL,53.10 μg/mL,26.550 μg/mL,13.275 μg/mL),每個(gè)濃度均進(jìn)樣10 μL。以溶液濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制安石榴苷、鞣花酸、沒(méi)食子酸各對(duì)照品響應(yīng)的擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線,經(jīng)測(cè)得安石榴苷回歸方程為y=52 421x+70 824(r=0.999 9),鞣花酸回歸方程為y=29 217x-32 100(r=0.999 9),沒(méi)食子酸回歸方程為y=34 094x+38 096(r=0.999 9)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,安石榴苷在13.120～209.92 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系,鞣花酸在13.325～213.20 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系,沒(méi)食子酸在13.275～212.40 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系。

3.1.2 高效液相色譜法系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

精密量取安石榴苷、鞣花酸和沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液10 μL,連續(xù)進(jìn)樣上述劑量的對(duì)照品溶液6次,測(cè)得安石榴苷、鞣花酸和沒(méi)食子酸的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)分別為0.6%、0.4%和0.3%。

3.1.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

量取上述方法制備的石榴皮供試品溶液適量,分別在0,1,3,5,7,12,24 h各加樣10 μL,測(cè)得供試品中安石榴苷、鞣花酸和沒(méi)食子酸的峰面積RSD分別為1.2%、0.9%和0.6%。

3.1.4 精密度實(shí)驗(yàn)

稱取等份石榴皮樣品干粉6份,每份取樣約 0.25 g,精密稱定適量,制備供試品溶液,測(cè)得安石榴苷、鞣花酸和沒(méi)食子酸的RSD分別為1.7%、1.4%和1.3%。

3.1.5 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

精密稱取等份石榴皮樣品6份,分別準(zhǔn)確加入安石榴苷對(duì)照品適量,測(cè)定石榴皮供試品所含安石榴苷的質(zhì)量并計(jì)算回收率,鞣花酸和沒(méi)食子酸對(duì)照品同法操作,石榴皮部位中安石榴苷、鞣花酸和沒(méi)食子酸回收率見(jiàn)表1。

表1 石榴皮中安石榴苷、鞣花酸和沒(méi)食子酸回收率及RSD

3.2 樣品含量測(cè)定

取安徽蚌埠市懷遠(yuǎn)產(chǎn)地石榴經(jīng)典品種2種,分別為白玉石榴(A品種)和紅酸石榴(B品種),制得石榴皮供試品待測(cè)溶液,采用外標(biāo)法同時(shí)測(cè)定石榴皮部位中安石榴苷、鞣花酸與沒(méi)食子酸的質(zhì)量比,測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 石榴皮中安石榴苷、鞣花酸和沒(méi)食子酸的含量(n=3)

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)反相高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)安徽本地特色石榴功能部位皮中多酚類物質(zhì)安石榴苷、鞣花酸、沒(méi)食子酸含量,考察了不同溶劑、時(shí)間、溫度條件下對(duì)樣品石榴皮中安石榴苷、鞣花酸、沒(méi)食子酸的提取效率的影響,結(jié)果表明,60%甲醇水溶液浸漬樣品12 h,再超聲(100 W)萃取45 min,提取回流溫度60℃,有利于安石榴苷、鞣花酸浸出;而80%乙醇水溶液浸提處理,有利于沒(méi)食子酸浸出;超聲處理樣品時(shí)長(zhǎng)分別為30 min、60 min時(shí),對(duì)應(yīng)的石榴皮多酚安石榴苷、鞣花酸、沒(méi)食子酸成分總量分別為8.11%、8.14%,對(duì)浸出率影響不大。此外,通過(guò)不同濃度(40%,60%,80%)的提取溶劑對(duì)石榴皮干粉進(jìn)行浸提,結(jié)果發(fā)現(xiàn)此不同溶劑浸提回收率由高到低依次為甲醇、乙醇、丙酮,從而,優(yōu)選甲醇溶劑。

通過(guò)PDA掃描,3個(gè)色譜主峰在272 nm 均有較強(qiáng)的紫外吸收且供試品溶液的雜質(zhì)峰在此波長(zhǎng)吸收較少,因此選擇272 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。安石榴苷、鞣花酸和沒(méi)食子酸均顯弱酸性,當(dāng)流動(dòng)相pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于三個(gè)主成分的酸解離常數(shù)值時(shí),這三種主成分主要以分子形式存在,因此選用磷酸溶液配比甲醇作為首選流動(dòng)相,色譜柱規(guī)格為250 mm×4.6 mm,5 μm,推薦流速為1.0 mL·min-1,在選擇進(jìn)樣量時(shí),考慮到檢測(cè)靈敏度,首選20 μL進(jìn)樣量,再逐步降低進(jìn)樣量到10 μL,三個(gè)主峰的峰型對(duì)稱度和理論塔板數(shù)都很好,考慮到安石榴苷峰分為安石榴苷A和B組成,同分異構(gòu)體在等度洗脫下難以分開(kāi),且分析時(shí)間較長(zhǎng),改為梯度洗脫:流動(dòng)相含甲醇(A)-0.2%磷酸溶液(B)梯度洗脫(0～9 min,94% B; 9～21 min,94%～85% B; 21～30 min,55% B;30～40 min,55%～45% B;40～48 min,94% B)。分析方法學(xué)驗(yàn)證指標(biāo)精密度良好(RSD<3%),溶液的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照品溶液放置室溫條件下,在24 h內(nèi)峰面積的RSD小于3%,準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。檢測(cè)圖譜中安石榴苷存在同分異構(gòu)現(xiàn)象,本次測(cè)算以總量計(jì)算。與相關(guān)文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道相比,提取液多使用醋酸乙酯及硼氫化鈉前處理,且干擾因素多,本實(shí)驗(yàn)采用甲醇水溶液進(jìn)行萃取,檢測(cè)波長(zhǎng)均為272 nm,流動(dòng)相條件也較簡(jiǎn)單,整體實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單,樣品收率穩(wěn)定且環(huán)境污染性小。

本實(shí)驗(yàn)采集了安徽懷遠(yuǎn)地區(qū)的不同優(yōu)良品種石榴皮樣品,并對(duì)樣品有效成分的安石榴苷、鞣花酸、沒(méi)食子酸總含量進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果表明,與紅酸石榴皮(B品種)相比,白玉石榴皮(A品種)所含安石榴苷和鞣花酸2種多酚類提取物的含量均有所增加,沒(méi)食子酸含量不變,利于安徽本地石榴皮多酚類物質(zhì)安石榴苷、鞣花酸、沒(méi)食子酸質(zhì)量同時(shí)檢測(cè)。此外,本研究通過(guò)反相高效液相色譜(RP-HPLC)初步建立了同時(shí)檢測(cè)安徽地區(qū)主品種石榴皮多酚類物質(zhì)含量的方法,可作為現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)藥典》中有關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的有效補(bǔ)充,且檢測(cè)方法靈敏度和準(zhǔn)確度高。