◎ 鄭小雙，貢湘磊，谷文成，孫長(zhǎng)花，胡 艷，梅 茹

（1.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇旅游職業(yè)學(xué)院 烹飪科技學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州市農(nóng)產(chǎn)品智能測(cè)控與清潔生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心，江蘇 揚(yáng)州 225009）

海產(chǎn)品食物中毒的主要原因是食源性致病菌，副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）就是一種主要的海洋致病菌，是全世界海產(chǎn)品細(xì)菌性食物中毒的主要病原菌。該菌主要存在于動(dòng)物的表面組織、海底沉積物及海水中，其最大的特點(diǎn)是需鹽才能生長(zhǎng)，因此海產(chǎn)品中常能分離出此菌。海產(chǎn)品可以為人們提供豐富的動(dòng)物蛋白質(zhì)，其需求量逐年增加。人們?cè)谑秤帽辉摼廴镜乃a(chǎn)品后，極易引起急性腸胃炎，通常表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、發(fā)燒和惡心，甚至敗血癥[1]。

控制食源性致病菌的傳統(tǒng)方法有物理（輻射、蒸汽、干熱）和化學(xué)兩種方法[2]，但食品經(jīng)過(guò)這兩種方法處理后感官品質(zhì)會(huì)受到影響。熱力殺菌技術(shù)由于溫度高，會(huì)使食物的色澤和風(fēng)味發(fā)生明顯的變化，食物的營(yíng)養(yǎng)也會(huì)流失。化學(xué)消毒劑具有腐蝕性強(qiáng)的特點(diǎn)，會(huì)損害食品加工設(shè)備。

抗生素是抵御細(xì)菌侵染的第一道防線，在水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜牧行業(yè)發(fā)揮著重要作用，但抗生素濫用會(huì)導(dǎo)致海產(chǎn)品和環(huán)境中耐藥細(xì)菌和抗性基因的傳播。食物中殘留的抗生素或被抗生素耐藥性病原體污染的食物會(huì)嚴(yán)重影響食品安全[3]。部分國(guó)家陸續(xù)發(fā)布了各種抗生素禁令。因此，需要研發(fā)替代方法控制海產(chǎn)品中的病原菌，新的生物抑菌劑應(yīng)該具有安全性高、高效且低廉的特點(diǎn)。

噬菌體是細(xì)菌的一種病毒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，主要由核酸和蛋白質(zhì)組成，有較強(qiáng)的宿主專(zhuān)一性，不感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，只能侵染特定的一類(lèi)或一種宿主菌。噬菌體是專(zhuān)門(mén)感染和裂解細(xì)菌的病毒，其數(shù)量龐大，易于篩選，成本低。根據(jù)噬菌體增殖方式的不同，可以將噬菌體分為溫和噬菌體和烈性噬菌體兩類(lèi)。溫和噬菌體的遺傳物質(zhì)能整合到宿主細(xì)胞的基因中，不能殺死宿主菌[4]。裂解性噬菌體作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層導(dǎo)致細(xì)菌裂解。噬菌體通過(guò)控制食源性病原菌來(lái)提高食品安全水平，本文就近年來(lái)對(duì)副溶血性弧菌噬菌體在食品中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 副溶血性弧菌噬菌體及其應(yīng)用

1.1 副溶血性弧菌噬菌體

許東勤等[5]對(duì)部分國(guó)內(nèi)外報(bào)道的副溶血性弧菌噬菌體的特性進(jìn)行綜述，發(fā)現(xiàn)這些噬菌體都是有尾的二十面體結(jié)構(gòu)，但是大小不同。噬箘體基因組在2 ～77 kb；噬箘體的最適生長(zhǎng)溫度為30 ～37 ℃；在30 ～60 ℃能保持熱穩(wěn)定性，pH=4 ～10 具有較高的活性；最佳感染復(fù)數(shù)隨著噬菌體的裂解產(chǎn)生較大差別。副溶血性弧菌噬菌體生長(zhǎng)條件的特殊性為噬菌體高效率的裂解宿主菌提供了良好的物理?xiàng)l件。

1.2 副溶血性弧菌噬菌體在減菌方面的應(yīng)用

副溶血性弧菌是海產(chǎn)品食物中毒的主要致病菌，許多研究人員將噬菌體應(yīng)用于污染了副溶血性弧菌的海產(chǎn)品、海產(chǎn)品加工設(shè)備和器具中，使該菌得到了有效控制。多數(shù)研究者報(bào)告了新發(fā)現(xiàn)的噬菌體，討論了噬菌體的單一療法，少數(shù)研究者討論了雞尾酒療法、與其他抗菌劑聯(lián)合使用。已經(jīng)報(bào)道的噬菌體主要來(lái)源于湖泊沉積物、海產(chǎn)品養(yǎng)殖場(chǎng)、海水、污水和土壤等環(huán)境中。在新鮮食品中分離到的噬菌體相對(duì)有限，從食物樣本中成功分離到噬菌體的關(guān)鍵取決于宿主菌的濃度，當(dāng)食物樣本中目標(biāo)細(xì)菌濃度較高時(shí)有利于噬菌體的分離。

江艷華等[6]探討了噬菌體VpJYP2 在4 ℃、15 ℃、25 ℃對(duì)生三文魚(yú)片中Vp 的控制，4 ℃條件下，在檢測(cè)7 d內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組在8 h未檢出菌落，之后也未檢出菌落。15 ℃條件下，在檢測(cè)4 d 內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組在8 h 菌落數(shù)降至最低，之后菌落數(shù)逐漸增加。4 ℃條件下，在檢測(cè)2 d內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組在4 h 菌落數(shù)未檢出，之后逐漸增加。試驗(yàn)結(jié)果顯示低溫對(duì)Vp 的抑菌效果較好，可能是由于在低溫條件下Vp 生長(zhǎng)緩慢，噬菌體裂解量相對(duì)增加。TAN 等[7]從血蛤、蝦和沖浪蛤30 份樣品中分離出6 株噬菌體。根據(jù)宿主范圍特異性組合兩種噬菌體混合物A（Vp33、Vp22、Vp21和Vp02）和B（Vp08、Vp11）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示噬菌體單獨(dú)使用、兩種混合物體外裂解活性效果均顯著，37 ℃培養(yǎng)24 h，單個(gè)噬菌體減菌量為2.85 ～4.60 lg CFU·mL-1。噬菌體混合物A 和B 減菌量分別為3.69 和4.81 lg CFU·mL-1。LEE 等[8]從牡蠣勻漿中分離出噬菌體VPG01，作用于人工海水中污染細(xì)菌的鹵蟲(chóng)50 h，鹵蟲(chóng)的存活率提高了30%。25 ℃條件下，又研究了VPG01 作為廚房設(shè)備和器具生物抑菌劑的可行性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VPG01 作用在切菜砧板上3 h，細(xì)菌數(shù)量減少3 個(gè)數(shù)量級(jí)。VPG01（MOI=10）作用在比目魚(yú)肉上6 h，細(xì)菌數(shù)降至檢測(cè)線以下水平。該研究將VPG01 和前期分離到的噬菌體VPT02 等量混合來(lái)抑制宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)，結(jié)果顯示兩種噬菌體存在拮抗關(guān)系，VPG01 或VPT02 單獨(dú)處理優(yōu)于混合處理。兩者在形態(tài)上都是相似的長(zhǎng)尾噬菌體科，基因組平均遺傳相似度為94.88%，拮抗作用可能是噬菌體重復(fù)感染抑制宿主細(xì)胞裂解。JANG 等[9]從魚(yú)類(lèi)和貝類(lèi)環(huán)境的濕沙和沉積物中分離噬菌體BPVP-3325。在液體培養(yǎng)基中處理6 h，實(shí)驗(yàn)組OD值明顯低于對(duì)照組。室溫噬菌體在牡蠣肉上應(yīng)用12 h，細(xì)菌數(shù)下降約4 lg CFU·g-1。REN 等[10]給海參喂食噬菌體預(yù)防和控制副溶血性弧菌，對(duì)照組海參存活率＜30%，噬菌體的處理組（MOI=10 和MOI=100）海參存活率提高到80%，并且高于抗生素處理組。AVT 等[11]從貽貝組織中分離出噬菌體KIT04，用不同濃度的噬菌體污染細(xì)菌培養(yǎng)物。結(jié)果顯示，裂解活性與MOI 成正比，MOI為100 時(shí)，能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)8 ～9 h。XIA 等[12]評(píng)估了F23s1 抑制蝦肉中Vp 的能力。25 ℃ F23s1 在12 h內(nèi)有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，菌落數(shù)下降1.92 lg CFU·g-1。YOU 等[13]從牡蠣中分離出噬菌體VPT02，作用于污染Vp 的鹽水蝦。MOI 為10 的噬菌體使鹽水蝦存活率從16.7%提高到46.7%。VPT02應(yīng)用于即食生魚(yú)肉片時(shí)，細(xì)菌數(shù)減少了3.9 lgCFU·g-1。

1.3 副溶血性弧菌噬菌體在控制生物膜方面的應(yīng)用

YANG 等[14]從污水中分離出噬菌體FE11，不僅能破壞已經(jīng)形成的生物膜，而且能阻止生物膜的形成，當(dāng)噬菌體濃度為1010pfu·mL-1時(shí)，才能顯著破壞形成的生物膜。但是MOI 為0.1 時(shí)，能抑制生物膜的形成。YIN 等[15]分離出3 株噬菌體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示單一噬菌體和雞尾酒都能顯著性抑制細(xì)菌生物膜的形成，但不能去除已經(jīng)形成的生物膜。研究人員分離到噬菌體采用的原理是噬菌體-宿主相互作用的特異性，噬菌體更有可能出現(xiàn)在其宿主所在的生態(tài)環(huán)境中。在試驗(yàn)條件下，噬菌體治療對(duì)于防治海產(chǎn)中的副溶血性弧菌有效，但是在侵染晚期，其控制抑菌能力有限。副溶血性弧菌噬菌體的研究方法仍需不斷探索和評(píng)估，不同地方分離出的噬菌體也存在地域差異。

2 噬菌體治療優(yōu)勢(shì)及目前存在的問(wèn)題

2.1 噬菌體雞尾酒的構(gòu)建注意事項(xiàng)

噬菌體與宿主菌的高度特異性，因此必須鑒定污染的細(xì)菌菌株，以便正確應(yīng)用噬菌體。噬菌體的高度特異性可通過(guò)采用較寬宿主范圍的噬菌體或噬菌體混合物來(lái)擴(kuò)大宿主范圍兩種方案來(lái)解決。然而，需要確定適宜的噬菌體雞尾酒宿主范圍，因?yàn)閷挼牧呀庾V可能會(huì)導(dǎo)致抗性菌株的產(chǎn)生或者殺死非目標(biāo)細(xì)菌?；旌衔镏惺删w數(shù)量也應(yīng)合理選擇，過(guò)多會(huì)增加成本，達(dá)不到理想的效果。要避免使用兩個(gè)基因組相近的噬菌體，當(dāng)兩株基因組相近的噬菌體侵染同一宿主菌時(shí)，核酸可能會(huì)重組，產(chǎn)生新的噬菌體，新的噬菌體宿主范圍和其他特性難以預(yù)測(cè)。

2.2 噬菌體治療的優(yōu)勢(shì)

噬菌體的宿主特異性是指只能侵染特定的宿主細(xì)胞，尤其在胃腸道靶向特定宿主細(xì)菌時(shí)，因?yàn)槭删w狹窄的宿主范圍不會(huì)影響其他內(nèi)源性細(xì)菌，對(duì)人體無(wú)害[16]。噬菌體混合使用減少了抗性菌株的出現(xiàn)、能夠區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞[17]。噬菌體以指數(shù)方式自我復(fù)制，能快速裂解宿主細(xì)胞。噬菌體在自然界中無(wú)處不在，相對(duì)容易分離到新的噬菌體用來(lái)抵抗新的病原體。

2.3 存在的問(wèn)題

噬菌體宿主范圍較窄，大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)只能侵染少部分菌株。噬菌體與宿主菌遺傳物質(zhì)相互作用，可能會(huì)導(dǎo)致抗性菌株或者新的致病菌株產(chǎn)生。噬菌體目前還未被大眾接受，許多國(guó)家還未獲批其安全性。為了提高噬菌體混合物應(yīng)用的有效性，還需要優(yōu)化混合物中每種噬菌體的比例和劑量。噬菌體的生物防控需要根據(jù)海產(chǎn)品的種類(lèi)、目標(biāo)細(xì)菌、噬菌體的保質(zhì)期制定合理的方案。噬菌體治療受時(shí)間限制，海產(chǎn)品出現(xiàn)癥狀后，需要花幾天時(shí)間分離和檢測(cè)細(xì)菌樣品，再匹配相應(yīng)的噬菌體，受污染的海產(chǎn)品可能被摧毀。

3 展望

噬菌體在實(shí)驗(yàn)室控制條件下，在體內(nèi)體外對(duì)副溶血性弧菌的控制效果明顯，其應(yīng)用效果受感染復(fù)數(shù)、治療方式、環(huán)境條件、目標(biāo)細(xì)菌等多種因素影響。噬菌體在食品工業(yè)可以應(yīng)用在不同階段，如直接作用于動(dòng)物、植物，也可用于食品工廠生產(chǎn)設(shè)備，防止細(xì)菌形成生物膜。但是噬菌體在各個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)方案、雞尾酒成分、作用時(shí)間與劑量均需要進(jìn)一步研究[18]。在噬菌體商業(yè)化應(yīng)用之前，需要評(píng)估噬菌體處理后海產(chǎn)品的安全性以及大量使用噬菌體后對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響[19]。