蔚丹 ， 馬云龍 ， 萬方 ， 武建強(qiáng)

1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010010；

2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010107

mRNA 疫苗是一種通過體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)合成后選擇合適的遞送系統(tǒng)將mRNA 運輸進(jìn)入機(jī)體，依靠細(xì)胞自身的翻譯系統(tǒng)將mRNA 翻譯成目標(biāo)蛋白，從而達(dá)到臨床治療目的的先進(jìn)療法［1］。早在1961 年就有科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了mRNA，但由于自身不穩(wěn)定且缺少高效的遞送載體，mRNA 疫苗的發(fā)展較緩慢。在最近的研究中，Karik?等［2］使用假尿苷代替尿苷來合成mRNA，不僅可以避免不良的免疫反應(yīng)，還可以提高分子穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)產(chǎn)量。2019 年新型冠狀病毒肺炎疫情爆發(fā)，Moderna 和BioNTech 公司的mRNA 新冠疫苗通過了美國食品藥品監(jiān)督管理局（US Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）的緊急授權(quán)并開始免疫接種，這些臨床應(yīng)用方面的重大進(jìn)展激起了mRNA疫苗的研究熱潮。雖然mRNA 疫苗的生產(chǎn)技術(shù)、有效性還需進(jìn)一步研究，但由于其自身優(yōu)勢，在未來的疾病預(yù)防及治療領(lǐng)域?qū)⒄紦?jù)一席之地。

1 mRNA疫苗的簡介

1.1 mRNA疫苗的概況

mRNA 疫苗是基于mRNA 指導(dǎo)蛋白合成的特性，在體外設(shè)計合成的含有編碼特定抗原的mRNA 序列，經(jīng)過必要的修飾和純化等加工，通過不同的方式遞送至人體細(xì)胞內(nèi)，直接翻譯產(chǎn)生抗原蛋白，模擬病毒感染并引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。與亞單位疫苗、滅活疫苗、減毒活疫苗和DNA疫苗相比，mRNA疫苗有以下優(yōu)點：①在安全性方面，mRNA 是非感染性、非整合性的，不存在潛在的感染或插入突變風(fēng)險；②在療效方面，各種修飾使mRNA 更加穩(wěn)定，使用陽離子脂質(zhì)體（lipid nano-particles，LNPs）將其包裹，可以實現(xiàn)高效的體內(nèi)遞送，使其快速進(jìn)入抗原遞呈細(xì)胞并表達(dá)；③在生產(chǎn)方面，由于體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)率較高，mRNA疫苗具有快速、經(jīng)濟(jì)和規(guī)?；a(chǎn)的潛力［3］。

1.2 mRNA疫苗的發(fā)展歷程

目前，由于mRNA疫苗的大規(guī)模應(yīng)用，關(guān)于這項技術(shù)起源的爭論愈演愈烈，事實上這項技術(shù)是30 多年來數(shù)百名研究人員的工作成果。1961 年，加州理工學(xué)院科學(xué)家首次成功提取到mRNA。1990 年，Wolff 等［4］將含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、熒光素酶和β-半乳糖苷酶基因的RNA 和DNA 表達(dá)載體分別注射到體內(nèi)小鼠骨骼肌中，并在肌肉細(xì)胞中檢測到了它們的表達(dá)。1992 年，科學(xué)家將來自正常大鼠下丘腦細(xì)胞中的mRNA注射到患有尿崩癥大鼠的下丘腦中，在注射后數(shù)小時內(nèi)觀察到尿崩癥的暫時逆轉(zhuǎn)［5］。1995年，研究人員將癌胚抗原基因注射入小鼠肌肉作為癌癥疫苗［6］。2002年，Heiser等［7］發(fā)現(xiàn)編碼前列腺特異性抗原的mRNA轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞（dendritic cell，DC）能夠在體外有效地刺激T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，并進(jìn)行了臨床試驗。2005年，匈牙利生物化學(xué)家Karikó［2］發(fā)現(xiàn)在mRNA中摻入修飾的核苷（m5C、m6A、m5U、s2U或假尿苷）后抑制了RNA激活DCs的潛力，即降低了mRNA在體內(nèi)的免疫原性。2009年，Weide等［8］將魚精蛋白-mRNA疫苗成功注射至黑色素瘤患者體內(nèi)，并證明這是安全可行的。2017年，Sahin等［9］證明了通過RNA 新表位疫苗靶向個體癌癥突變的臨床可行性、安全性和抗腫瘤活性。2019 年，新型冠狀病毒肺炎疫情爆發(fā)，多種mRNA 疫苗作為新型冠狀病毒疫苗獲得緊急授權(quán)并投入使用［10］，如Moderna 公司的mRNA-4157 和BioNTech公司的BNT122，在全球掀起了新一輪mRNA 研究的熱潮。

1.3 mRNA疫苗的作用機(jī)制

在疫苗接種過程中，mRNA 疫苗在抗原遞呈細(xì)胞（antigen-presenting cells，APCs）中表達(dá)抗原，促進(jìn)APC 活化并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異的細(xì)胞免疫和體液免疫［11-12］?？乖f呈細(xì)胞包括樹突狀細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等。mRNA疫苗引發(fā)免疫反應(yīng)的過程如圖1所示。

圖1 mRNA疫苗引發(fā)免疫反應(yīng)的過程圖Fig. 1 Process of mRNA vaccine-induced immune response

2 mRNA疫苗的修飾

雖然mRNA 早在1961 年被科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，但由于其穩(wěn)定性和翻譯效率較低、免疫原性較高等原因，相關(guān)研究進(jìn)展較緩慢，可通過優(yōu)化mRNA的序列和結(jié)構(gòu)來提高其穩(wěn)定性和翻譯效率，通過修飾核苷酸來降低其免疫原性。

2.1 5′Cap結(jié)構(gòu)的修飾

Cap 結(jié)構(gòu)位于mRNA 的5′端，由甲基化的鳥苷酸（m7G）經(jīng)焦磷酸化后與mRNA 的5′端核苷酸相連，在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄時，傳統(tǒng)的Cap 結(jié)構(gòu)有Cap0（m7GpppXpYp）、Cap1（m7GpppXmpYp）、Cap2（m7GpppXmpYmp）3種。它與翻譯水平密切相關(guān)，當(dāng)mRNA到達(dá)細(xì)胞質(zhì)時，Cap與Poly A尾發(fā)生協(xié)同作用，與翻譯起始因子4F（eIF4F）形成穩(wěn)定的閉環(huán)結(jié)構(gòu)［13］，促進(jìn)翻譯起始，在mRNA翻譯中發(fā)揮重要作用。此外，對mRNA進(jìn)行加帽后，可使5′端的末端游離磷酸基團(tuán)缺失，進(jìn)而不被堿性磷酸酶降解，并且Cap1 和Cap2 mRNA 核苷酸上的甲基能夠?qū)⒘姿狨ユI上游離的2′OH基團(tuán)封閉，不會被RNA酶降解［14］，因此Cap結(jié)構(gòu)對mRNA有保護(hù)作用。

目前有2 種加帽方法。①轉(zhuǎn)錄后加帽（酶法加帽）。使用專門的酶對來自體外轉(zhuǎn)錄的mRNA進(jìn)行加帽反應(yīng)，例如工業(yè)上常使用的牛痘病毒加帽酶（vac-cinia virus capping enzyme，VCE），它將m7G封端至mRNA的5′端。此方法加帽效率較高，但可能會造成5′端產(chǎn)物的異質(zhì)性。②共轉(zhuǎn)錄加帽。在T7 聚合酶反應(yīng)的同時，使用抗逆轉(zhuǎn)帽類似物（anti-reverse cap analogues，ARCA）進(jìn)行共轉(zhuǎn)錄加帽。ARCA 是一種帽狀二聚體，此方法操作簡單，但在轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，體外轉(zhuǎn)錄的原料GTP會與ARCA產(chǎn)生競爭，因此該方法的加帽效率僅能達(dá)到80%。

2.2 密碼子的優(yōu)化

原始編碼區(qū)的密碼子在體內(nèi)可合成氨基酸，但一部分密碼子的翻譯效率不高，因此可以參照密碼子使用頻率表（表1）將使用頻率較低的密碼子替換，提高密碼子的翻譯效率［15-16］。

表1 密碼子使用頻率Table 1 Codon usage frequency

有研究表明，將第3 位是A、U 的密碼子替換為第3位是G、C的密碼子［17-18］，降低U 的含量可降低mRNA 在體內(nèi)的免疫原性，也可提高所使用密碼子的翻譯水平，但GC 含量不是越高越好。此外，應(yīng)排除編碼區(qū)序列中含有的酶切位點，防止后續(xù)的酶切反應(yīng)破壞編碼序列。

2.3 UTR的修飾

5′端UTR含有與mRNA轉(zhuǎn)運和翻譯相關(guān)的調(diào)控序列，可抑制核酸外切酶對mRNA的降解，同時能夠與內(nèi)部核糖體的位點相結(jié)合［19］。在5′UTR中加入的Kozak序列（G/ANNATGG）可與翻譯起始因子結(jié)合避免錯誤起始，提高mRNA的翻譯效率［20］。

3′UTR 除抑制核酸外切酶對mRNA 的降解外，還可與Poly A 尾發(fā)揮協(xié)同作用來提高mRNA疫苗的穩(wěn)定性和翻譯效率。也有研究表明，使用人類α 和β 球蛋白的3′UTR 可增強(qiáng)mRNA 的穩(wěn)定性和翻譯效率［21］。

2.4 Poly A尾的修飾

真核生物中mRNA 添加Poly A 尾是一個默認(rèn)的過程，幾乎所有真核生物的mRNA 通過轉(zhuǎn)錄后修飾，都會獲得100～150 個堿基的Poly A 尾，它在發(fā)育和細(xì)胞周期期間受到動態(tài)調(diào)節(jié)［22］，不同長度的Poly A 尾有助于調(diào)節(jié)mRNA 的穩(wěn)定性、運輸和翻譯效率［23］。

在缺少ATP 的情況下，可以使用T4多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase，T4 PNK）對帶有3′磷酸的mRNA 進(jìn)行末端修復(fù)。當(dāng)mRNA 到達(dá)細(xì)胞質(zhì)，Poly A 尾與5′Cap 發(fā)生協(xié)同作用，通過形成mRNA 閉環(huán)模型促進(jìn)翻譯起始［24］。此外，Poly A尾有助于mRNA從核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運及延長半衰期、增加佐劑效應(yīng)。

目前有2 種加尾方法。①DNA 模板含Poly A尾。轉(zhuǎn)錄模板中加入100～150 bp堿基A，在細(xì)菌培養(yǎng)等過程中可能會發(fā)生突變導(dǎo)致Poly A減少，破壞編碼序列，可使用A30-linker-A70 增加穩(wěn)定性［18］。②酶法加尾。體外轉(zhuǎn)錄后使用Poly A聚合酶完成，通過調(diào)整反應(yīng)時間和酶用量來控制堿基A 的數(shù)量，操作簡便，但得到的Poly A的數(shù)量不穩(wěn)定。

2.5 核苷酸的修飾

體外轉(zhuǎn)錄mRNA的免疫原性較高是一個亟待解決的問題，免疫細(xì)胞可被體外轉(zhuǎn)錄的mRNA 激活并誘導(dǎo)Toll 樣受體引起炎癥反應(yīng)［25］，從而被免疫系統(tǒng)清除。有研究發(fā)現(xiàn)，體外轉(zhuǎn)錄的mRNA 用假尿苷（ψ）、N1-甲基-假尿苷（m1ψ）或5-甲氧基尿苷（5 moU）代替尿苷可以增強(qiáng)其翻譯效率并降低免疫原性。假尿苷是由尿苷通過堿基異構(gòu)化反應(yīng)衍生的，其中核堿基圍繞N3—C6 軸旋轉(zhuǎn)180°，導(dǎo)致核堿基-糖鍵發(fā)生變化（從N1―C1′鍵變?yōu)镃5―C1′鍵），由此產(chǎn)生的C―C鍵能夠使核堿基更自由地旋轉(zhuǎn)，假尿苷也可像尿苷一樣與腺苷進(jìn)行堿基配對，但假尿苷可以通過改善堿基配對、堿基堆疊和主鏈穩(wěn)定性來改變mRNA結(jié)構(gòu)（圖2）。N1-甲基-假尿苷和假尿苷具有一個關(guān)鍵的共同特征，即C5―C1′鍵，它有助于改善堿基配對、堿基堆疊和雙鏈穩(wěn)定性［26-27］。與尿苷相比，N1-甲基-假尿苷與A配對具有更高的親和力，從而實現(xiàn)更有效地翻譯［28-29］；也有研究者發(fā)現(xiàn)，可以用N1-甲基腺苷（m1A）或N6-甲基腺苷（m6A）代替天然腺苷，m6A是大多數(shù)真核生物中mRNA 和長鏈非編碼RNA 最豐富的內(nèi)部修飾元件，它和mRNA的穩(wěn)定性、剪接加工及翻譯有關(guān)［30-31］。此外，還可用5-甲基胞苷（m5C）代替天然胞苷，m5C已在各種代表性生物的mRNA、rRNA和tRNA 中發(fā)現(xiàn)。作為可逆的表觀遺傳修飾，m5C修飾可增強(qiáng)mRNA 的穩(wěn)定性，促進(jìn)剪接和核質(zhì)運輸?shù)龋?2-33］。Yamamoto 等［34］發(fā)現(xiàn)使用25% 5-甲基胞苷和25% 2-硫尿苷分別代替胞苷和尿苷的效果更好。Andries 等［29］發(fā)現(xiàn)m1ψ 和m5C 聯(lián)合使用的效果優(yōu)于只使用假尿苷或5-甲基胞苷。無論是體內(nèi)試驗還是體外實驗都表明，替換后的核苷酸在有效降低mRNA免疫原性的同時，顯著提高了翻譯效率。

圖2 核苷酸的基本結(jié)構(gòu)與化學(xué)修飾Fig. 2 Basic structure and chemical modification of nucleotides

3 mRNA疫苗的遞送系統(tǒng)

mRNA 進(jìn)入細(xì)胞并成功表達(dá)后，易被RNA 酶降解，因此需使用能夠抵御降解的載體來遞送mRNA。目前，已經(jīng)開發(fā)了多種遞送載體，如脂質(zhì)納米顆粒（LNP）、聚合物載體、病毒載體類病毒載體等。

3.1 LNP

LNPs遞送系統(tǒng)主要由陽離子脂質(zhì)體和其他輔助脂質(zhì)體組成，陽離子脂質(zhì)體與帶負(fù)電的mRNA結(jié)合，可實現(xiàn)較高的包載效果，形成直徑小于200 nm的復(fù)合物，在體內(nèi)由低密度脂蛋白介導(dǎo)的胞吞機(jī)制可使納米粒子成功被細(xì)胞攝取，進(jìn)而實現(xiàn)良好的細(xì)胞攝取效果。LNP 可以在內(nèi)核中攜帶mRNA并避免RNA 酶的降解，LNP 的親脂性可使它和細(xì)胞膜融合，完成mRNA的遞送。

3.2 魚精蛋白

魚精蛋白是一種堿性蛋白質(zhì)，主要在魚類成熟精子的細(xì)胞核中作為和DNA 結(jié)合的核精蛋白存在。魚精蛋白也是一種天然的陽離子蛋白，與帶負(fù)電的mRNA 絡(luò)合成納米級別的核酸顆粒，保護(hù)其不被降解［35］。但由于魚精蛋白與mRNA結(jié)合的較緊密，使它在體內(nèi)的表達(dá)效率降低，因此魚精蛋白使用率較低。

3.3 聚合物載體

常用的聚合物遞送載體有聚酰胺、聚β氨基酯和聚乙烯亞胺等，其中聚乙烯亞胺的應(yīng)用較廣泛。由于聚合物載體的不良反應(yīng)較強(qiáng)，且和mRNA結(jié)合比較緊密，因此使用率也較低。此外，Prieve等［36］發(fā)明了一種新的遞送技術(shù)——結(jié)合脂質(zhì)和聚合物顆粒來遞送mRNA，這種遞送載體包含聚合物膠束和LNP 2 種納米粒子，其中聚合物膠束以肝細(xì)胞為靶點，促進(jìn)mRNA 在內(nèi)體中的釋放并產(chǎn)生特異性蛋白質(zhì)。

3.4 病毒載體

一些正鏈RNA 病毒，如甲病毒屬（辛德華斯病毒、福斯特病毒）、小核糖核酸病毒、黃病毒、仙臺病毒等可攜帶目的基因進(jìn)入人體細(xì)胞核，可用于mRNA的遞送。

3.5 類病毒載體

已有研究人員開發(fā)了工程化無DNA 類病毒顆粒（virus-like particles，eVLP），這種類病毒顆粒在逆轉(zhuǎn)錄病毒的基礎(chǔ)上做了大量改造和優(yōu)化，以解決包裝、遞送和釋放中存在的問題。它能夠在人類細(xì)胞、多種小鼠器官和組織（如肝臟、大腦、眼睛）中進(jìn)行有效的基因編輯［37］。eVLP 是由病毒蛋白組裝而成的小顆粒，可模擬病毒進(jìn)入細(xì)胞并運送分子貨物，在顆粒表面使用不同的分子，就可遞送到不同的目的地。由于eVLP 內(nèi)沒有病毒的遺傳物質(zhì)，不會在細(xì)胞中插入外來的DNA，因此被認(rèn)為比用真正病毒作載體的遞送方法更安全。

4 mRNA疫苗應(yīng)用進(jìn)展

2020年，有研究人員開發(fā)了黑色素瘤疫苗Fix-Vac，它是一種通過靜脈注射的納米顆粒脂質(zhì)體mRNA 疫苗，其能靶向作用于淋巴組織中未成熟的樹突狀細(xì)胞，并驅(qū)動腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigens，TAAs）在MHC Ⅰ類和Ⅱ類分子上呈現(xiàn)［38］。研究人員通過利用TLR 配體刺激后細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的消耗來判斷FixVac 是否靶向，在RNA-LPX 注射后進(jìn)行［18F］-氟-2-脫氧-2-d-葡萄糖-正電子發(fā)射斷層掃描/計算機(jī)斷層掃描，發(fā)現(xiàn)脾臟中葡萄糖代謝活性顯著增加，表明免疫細(xì)胞進(jìn)行了快速靶向和瞬時激活［39］。研究者又通過測量血漿中細(xì)胞因子含量來評估佐劑性，IFN-α、IFN-γ、IL-6、IFN-IP-10 和IL-12 p70 含量隨著Fix-Vac 劑量的增加而增加，并伴有體溫的短暫升高，細(xì)胞因子含量在治療后2～6 h達(dá)到高峰，并在24 h內(nèi)恢復(fù)正常［40］。這種疫苗包含了4 種TAAs，分別是NY-ESO-1、MAGE-A3、酪氨酸酶和TPTE，通過誘導(dǎo)機(jī)體的效應(yīng)T細(xì)胞對TAAs產(chǎn)生反應(yīng)，并介導(dǎo)免疫檢查點阻滯劑（immune checkpoint blockades，ICB）對晚期黑色素瘤患者產(chǎn)生持久的反應(yīng)［41］。ELISPOT 分析表明，患者在接種疫苗后至少對一種TAA 產(chǎn)生特異性T 細(xì)胞反應(yīng)，其中大多數(shù)僅表現(xiàn)為CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)，少數(shù)患者表現(xiàn)出CD8+和CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)。在每月接受FixVac 增強(qiáng)劑的患者體內(nèi)，TAA 特異性效應(yīng)T 細(xì)胞的頻率繼續(xù)增加或保持穩(wěn)定，但在沒有連續(xù)接種疫苗的患者體內(nèi)記憶T 細(xì)胞也持續(xù)存在。某些患者在PD-1 抑制劑治療失敗后接種FixVac 疫苗，會出現(xiàn)腫瘤消退的現(xiàn)象，而在接受過ICB 的患者中，接受FixVac和抗PD-1 聯(lián)合治療的患者腫瘤消退率超過35%，因此FixVac 疫苗既可作為單一藥物使用，也可與抗PD-1抑制劑協(xié)同作用達(dá)到抗腫瘤效果。

2022 年美國癌癥研究所（Cancer Research Institute）進(jìn)行了一項臨床試驗旨在評估NSCLC檢查點抑制劑與mRNA疫苗聯(lián)合治療的安全性和初步療效。該mRNA疫苗包含6種抗原，分別是MUC1、survivin、NY-ESO-1、5T4、MAGE C2 及MAGE C1。臨床試驗中病人分為2組，A組接受mRNA疫苗和PD-1 抑制劑治療，B 組接受mRNA 疫苗和PD-1 抑制劑、CTLA-4抑制劑治療，結(jié)果顯示，B組患者的治療效果較好，且接受治療后出現(xiàn)的不良反應(yīng)癥狀較輕，死亡人數(shù)較少（臨床試驗編號 NCT03164772）。

2022年6月，中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、沃森生物公司和艾博生物公司合作完成了一項在300 名中國成年人中進(jìn)行的臨床試驗，結(jié)果顯示接種兩劑滅活新冠疫苗后，使用mRNA 疫苗ARCoV（也叫作AWcorna）作為第三針加強(qiáng)針，與繼續(xù)使用滅活疫苗作為加強(qiáng)針相比，能夠引發(fā)更強(qiáng)的針對新冠野生毒株、Delta 突變株和Omicron 突變株的免疫反應(yīng)。這項臨床試驗證實了ARCoV 作為第三針疫苗接種的安全性和有效性，也標(biāo)志著我國第一個mRNA疫苗有望獲批。

5 展望

隨著研究的不斷深入，mRNA 疫苗技術(shù)已經(jīng)日漸成熟，Karikó 等［2，26］的研究使其翻譯效率和穩(wěn)定性提高，各種遞送系統(tǒng)使其成功進(jìn)入人體細(xì)胞并激發(fā)高效的免疫應(yīng)答。從mRNA 本身的特性、引發(fā)的免疫反應(yīng)情況等方面來看，mRNA 疫苗優(yōu)于亞單位疫苗、滅活疫苗等。但mRNA 疫苗大規(guī)模用于人體的時間尚短，需進(jìn)行長期不良反應(yīng)監(jiān)測，以驗證其安全性及有效性［42］。到目前為止，在癌癥的免疫治療中通過將mRNA轉(zhuǎn)入樹突狀細(xì)胞方面存在瓶頸，使mRNA 疫苗在治療方面的應(yīng)用受到限制，將其應(yīng)用于不同類型疾病的治療研究還需不斷的拓展?？傊琺RNA 疫苗的研究在疾病預(yù)防、治療等方面具有重大意義。