宋開(kāi)南 ， 艾羽桐 ， 徐玉泉

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所， 北京 100081

萜類化合物是由多個(gè)異戊二烯單元構(gòu)成的烴類含氧衍生物，在自然界中分布廣泛，是天然產(chǎn)物中占比最高的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物。萜類化合物因其復(fù)雜的骨架結(jié)構(gòu)與優(yōu)良的藥理、生理活性，在食品、化工、醫(yī)藥和能源等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，常見(jiàn)的萜類化合物有倍半萜青蒿素、二萜銀杏內(nèi)酯和三萜甘草次酸等［1-2］。

目前，萜類化合物的獲取方式主要有植物提取法、化學(xué)合成法與細(xì)胞工廠合成法。傳統(tǒng)的植物提取法具有產(chǎn)物含量低、分離純化難度大、植物種植周期長(zhǎng)等局限性；化學(xué)合成法也存在著能耗高、效率低、環(huán)境不友好等缺點(diǎn)；細(xì)胞工廠合成法則具有周期短、成本低、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)［3-4］。近年來(lái)，科學(xué)家們利用微生物細(xì)胞工廠高效合成萜類化合物取得了突破性進(jìn)展。如李春等［5］在釀酒酵母中過(guò)表達(dá)MVA 途徑限速酶，偶聯(lián)半乳糖代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并經(jīng)過(guò)發(fā)酵調(diào)控優(yōu)化，使得五環(huán)三萜齊墩果酸的產(chǎn)量達(dá)到606.9 mg·L-1。張學(xué)禮等［6］從山楂中鑒定出細(xì)胞色素P450酶CYP716C49，利用工程化釀酒酵母對(duì)其異源表達(dá)，合成了熊果酸和科羅索酸，其中科羅索酸的產(chǎn)量達(dá)到141 mg·L-1。然而，利用微生物細(xì)胞工廠合成萜類化合物的產(chǎn)量仍不能滿足市場(chǎng)日益增長(zhǎng)的需求［7］，并且常用的底盤(pán)細(xì)胞釀酒酵母并不能準(zhǔn)確地識(shí)別其他真核生物基因的內(nèi)含子和外顯子，P450 酶在釀酒酵母中的功能性表達(dá)難度很大，故而尋找新的底盤(pán)細(xì)胞勢(shì)在必行［8］。

本研究從土壤中分離得到一株高產(chǎn)萜類化合物的絲狀直菌Stilbellasp. CGMCC 40422，通過(guò)核磁共振與高效液相色譜等方法對(duì)萜類產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)量進(jìn)行研究，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)萜類化合物生產(chǎn)的底盤(pán)細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1儀器 Agilent 核磁共振波譜儀（600 MHz DD2 型）；Agilent 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（1290 ⅡUHPLC，G6125B單四極質(zhì)譜）；Agilent制備型高效液相色譜儀（1260 Ⅱ型）；Agilent 半制備Eclipse XDB-C18 反相柱（9.4 mm×250 mm，5 μm）；BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-300 型）；TOMY 高壓蒸汽滅菌鍋（SX-500型）；CRYSTAL恒溫振蕩器（IS-RDS3）；默克milli-Q 超純水系統(tǒng)；BUCHI 中壓制備液相色譜（C-605型）；Eppendorf高速冷凍離心機(jī)（5425型）。

1.1.2試劑 青島海洋化工廠柱層析用硅膠（200～300 目）；YMC 公司反相硅膠基C18 填料；天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司二氯甲烷、無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、石油醚（分析純）；美國(guó)TEDIA 公司甲醇、乙腈（色譜純）；上海吉至DNA 提取液（25∶24∶1）；上海吉至核酸提取液（24∶1）；索萊寶3 mol·L-1乙酸鈉（pH 5.2）；諾唯贊2×Phanta Max Master Mix；Biowest瓊脂糖；索萊寶50×TAE緩沖液。

1.1.3培養(yǎng)基配制 孟加拉紅固體培養(yǎng)基：在1 L蒸餾水中加入36.7 g 索萊寶公司孟加拉紅培養(yǎng)基，攪拌均勻后120 ℃高壓滅菌20 min。PDB培養(yǎng)基：在1 L 蒸餾水中加入35 g 馬鈴薯葡萄糖粉末，攪拌均勻后120 ℃高壓滅菌20 min。大米培養(yǎng)基：將50 g 大米與50 mL 蒸餾水加入500 mL 錐形瓶中，靜置2 h 后120 ℃高壓滅菌20 min。YES 固體培養(yǎng)基：酵母提取物20 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蔗糖150 g，ZnSO4·7H2O 10 mg，CuSO4·5H2O 5 mg，瓊脂15.0 g，蒸餾水定容至1 L，攪拌均勻后120 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種分離與鑒定 實(shí)驗(yàn)所用菌株Stilbellasp.分離自海南高山土壤，采用稀釋平板法［11］對(duì)真菌進(jìn)行分離。取200 mg土樣置于裝有小鋼珠的1.5 mL EP 管中，加入800 μL 無(wú)菌水稀釋破碎混勻，隨后用無(wú)菌水稀釋1 000倍，土壤濁液涂布在孟加拉紅固體培養(yǎng)基上。當(dāng)觀察到有新菌落形成時(shí)，立即將其轉(zhuǎn)接到PDA 固體培養(yǎng)基上，之后繼續(xù)純化以獲得單一菌落。最后用20%甘油于-80 ℃保存菌株。菌株Stilbellasp.現(xiàn)保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)CGMCC 40422。

將真菌接種在YES 固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)14 d，總DNA 提取采用CTAB 法［12］。采用真菌ITS通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）作為上下游引物擴(kuò)增ITS序列，引物由金唯智生物科技有限公司合成。每個(gè)PCR反應(yīng)體系為（30 μL）：上下游引物各1.2 μL，稀釋50 倍的總DNA 模板0.6 μL，2×Phanta Max Master Mix 15 μL，ddH2O 12 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。取3 μL PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，成功擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物送至金唯智生物技術(shù)有限公司測(cè)序，再用Vector NTI 軟件將序列進(jìn)行雙向拼接。將獲得的序列在NCBI 網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov）上進(jìn)行Blast 比對(duì)，選取同源性較高的菌株序列，用MEGA 11.0 中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，再用Bootstrap 對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)1 000次。

1.2.2發(fā)酵條件 用無(wú)菌接種環(huán)從Stilbellasp.菌株凍存管中挑取菌絲，接種到2 瓶裝有250 mL PDB 錐形瓶中，28 ℃恒溫振蕩（120 r·min-1）培養(yǎng)3 d 作為種子液。將種子液接種至大米固體培養(yǎng)基中（每瓶50 g 大米，50 mL 純水，120 ℃高壓滅菌，共接種100瓶），室溫下靜置培養(yǎng)10 d。

1.2.3提取分離 將大米培養(yǎng)基發(fā)酵物干燥后進(jìn)行機(jī)械粉碎，乙酸乙酯浸泡提取3次，合并提取液，減壓濃縮得總浸膏?？偨嘟?jīng)硅膠（200～300 目）柱層析（石油醚—乙酸乙酯，體積比1∶0→0∶1）梯度洗脫，運(yùn)用薄層色譜法與高效液相分析（high performance liquid chromatography，HPLC）合并后得到9 個(gè)主流分Fr.1～Fr.9。其中Fr.2 經(jīng)反相ODS柱層析（甲醇—水，體積比1∶9→1∶0）及半制備型HPLC（乙腈—水，體積比68∶32）純化得到化合物3（2.1 mg）、化合物4（7.0 mg）、化合物5（4.8 mg）、化合物6（5.4 mg）和化合物8（7.3 mg）。Fr.5 經(jīng)反相ODS 柱層析（甲醇—水，體積比1∶9→1∶0）及半制備型HPLC（乙腈—水，體積比57∶43）純化得到化合物1（47.3 mg）和化合物2（5.9 mg）。Fr.7經(jīng)反相ODS 柱層析（甲醇—水，體積比1∶9→1∶0）及半制備型HPLC（乙腈—水，體積比33∶67）純化得到化合物7（4.6 mg）。

1.2.4煙曲霉酸含量測(cè)定 采用HPLC 對(duì)真菌發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯粗提物中主成分煙曲霉酸的含量進(jìn)行測(cè)定，以純化的煙曲霉酸作為對(duì)照品。HPLC條件：以60%色譜乙腈/水作為流動(dòng)相，采用Eclipse Plus C18分析型色譜柱（100 mm×2.1 mm×3.5 μm），柱溫25 ℃，流速0.35 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，進(jìn)樣量2 μL。

儀器精密度實(shí)驗(yàn)。精密稱取10 mg煙曲霉酸純品于EP 管中，加入10 mL 色譜甲醇溶解，超聲處理20 min，溶解為1 mg·mL-1。取該溶液300 μL，加色譜甲醇至1 mL，稀釋至0.3 mg·mL-1，連續(xù)使用HPLC檢測(cè)5次，統(tǒng)計(jì)各次化合物峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值，以確認(rèn)儀器精密度是否良好。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。依次吸取上述1 mg·mL-1煙曲霉酸溶液100、200、300、400、500 μL于EP管中，再分別加入色譜甲醇至1 mL，超聲處理20 min，得到主成分化合物對(duì)照品系列溶液。使用HPLC對(duì)上述系列對(duì)照品溶液檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)對(duì)應(yīng)色譜峰的峰面積，然后將對(duì)照品的質(zhì)量濃度（mg·mL-1）作為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積作為縱坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。稱取粗提物浸膏20 mg 于EP管中，加入色譜甲醇4 mL，超聲處理20 min，溶解為5 mg·mL-1。吸取該溶液100 μL，加入色譜甲醇至1 mL，稀釋至0.5 mg·mL-1。然后將該溶液于0、2、4、6、8 h重復(fù)進(jìn)樣。分別統(tǒng)計(jì)這5次測(cè)量的峰面積并計(jì)算RSD值，以確認(rèn)樣品溶液在8 h內(nèi)是否穩(wěn)定。

重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)。分別制備5份濃度為0.5 mg·mL-1供試品溶液，制備方法同穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。將5份溶液進(jìn)行HPLC 檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)這5 次測(cè)量的峰面積并計(jì)算RSD值，以確認(rèn)該測(cè)定方法是否具有良好的重現(xiàn)性。

加樣回收試驗(yàn)。依次吸取上述1 mg·mL-1對(duì)照品溶液200、400、600 μL至EP管中，再分別加入色譜甲醇至1 mL，配制成0.2、0.4、0.6 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。分別取對(duì)照品溶液各200μL至3個(gè)EP管中，再各自加入200 μL已知主成分含量的0.5 mg·mL-1粗提物供試品溶液，超聲處理20 min。將3 份混合樣品依次進(jìn)行HPLC 測(cè)定，計(jì)算加入對(duì)照品的回收率。

煙曲霉酸含量測(cè)定。分別稱取50 g大米制作21 瓶大米培養(yǎng)基，于菌株發(fā)酵第3、6、9、12、15、18、21 d各取3瓶，用1.2.3的方法提取濃縮后，溶解于100 mL 甲醇中。使用HPLC 檢測(cè)各溶液，統(tǒng)計(jì)峰面積并得出煙曲霉酸與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定結(jié)果

將菌株CGMCC 40422 經(jīng)18S rDNA-ITS 基因測(cè)序后，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中利用Blast進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌株ITS序列與Stilbella fimetaria（登錄號(hào)FJ430712）和S. fimetaria（登錄號(hào)為KX446764）相似性均為99%。進(jìn)一步從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)選擇S. fimetaria及其近緣種的rDNA-ITS序列，與菌株CGMCC 40422 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，菌株CGMCC 40422與S. fimetaria（登錄號(hào)FJ430712）和S. fimetaria（登錄號(hào)KX446764）處于同一分支上，可信度為62%，與其他近緣種有遺傳距離（圖1）。綜合分析，將菌株CGMCC 40422初步鑒定為Stilbellasp.。

圖1 菌株CGMCC 40422與近緣種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 1 Phylogenetic tree of strain CGMCC 40422 and related varieties

2.2 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

本研究從Stilbellasp. CGMCC 40422 的大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中共分離共得到8 個(gè)萜類化合物（圖2），具體結(jié)構(gòu)解析如下。

圖2 化合物1～8的結(jié)構(gòu)式Fig. 2 Structures of compounds 1～8

化合物1 為無(wú)色晶體，ESI-MSm/z： 567.2［MH］-，分子式為C33H44O8；1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.30（1H， d，J=10.0 Hz， H-1），5.84（1H， m， H-2），2.76（1H， m， H-4），2.25（1H， m， H-5），5.22（1H，m， H-6），2.60（1H， m， H-9），1.56～1.95（2H， m，H-11），1.80～2.40（2H， m， H-12），2.56（1H， m， H-13），1.89～2.22（2H， m， H-15），5.85（1H， m， H-16），0.91（3H， s， H-18），1.43（3H， s， H-19），2.47（2H， m， H-22），2.06～2.13（2H， m， H-23），5.09（1H， t，J=7.0 Hz， H-24），1.59（3H， s， H-26），1.68（3H， s， H-27），1.26（3H， d，J=6.8 Hz， H-28），1.17（3H， s， H-29），2.10（3H， s， H-2'），1.92（3H， s， H-4'）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：157.6（C-1），127.9（C-2），201.6（C-3），40.5（C-4），47.3（C-5），73.9（C-6），208.9（C-7），52.8（C-8），41.8（C-9），38.3（C-10，24.0（C-11），26.0（C-12），49.5（C-13），46.7（C-14），40.7（C-15），73.6（C-16），147.9（C-17），18.1（C-18），27.6（C-19），130.5（C-20），174.8（C-21），28.6（C-22），28.5（C-23），122.9（C-24），133.0（C-25），17.9（C-26），25.8（C-27），13.2（C-28），18.4（C-29），169.0（C-1'），20.8（C-2'），170.3（C-3'），20.6（C-4'）。上述數(shù)據(jù)與Fujimoto等［13］報(bào)道基本一致，故確定化合物1為煙曲霉酸。

化合物2：無(wú)色晶體，ESI-MSm/z：525.2［M-H］-，分子式為C31H42O7；1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.31（1H， d，J=10.0 Hz， H-1），5.85（1H， m， H-2），2.68（1H， m， H-4），2.23（1H， m， H-5），4.00（1H， m，H-6），2.56（1H， m， H-9），1.53～1.92（2H， m，H-11），1.74～2.41（2H， m， H-12，2.56（1H， m，H-13），1.84～2.21（2H， m， H-15），5.85（1H， m，H-16），0.94（3H， s， H-18），1.54（3H， s， H-19），2.42（2H， m， H-22），2.01～2.15（2H， m， H-23），5.09（1H， t，J=6.9 Hz， H-24），1.60（3H， s， H-26），1.68（3H， s， H-27），1.21（3H， d，J=6.7 Hz， H-28），1.12（3H， s， H-29），1.95（3H， s， H-2'）；13CNMR（150 MHz，CD3OD）δ：158.4（C-1），127.7（C-2），202.4（C-3），40.1（C-4），47.2（C-5），73.9（C-6），215.7（C-7），52.5（C-8），41.5（C-9），38.4（C-10），24.2（C-11），26.1（C-12），49.7（C-13），46.6（C-14），41.0（C-15），73.9（C-16），148.6（C-17），18.0（C-18），28.3（C-19），130.5（C-20），174.0（C-21），28.6（C-22），28.6（C-23），122.9（C-24），133.0（C-25），17.9（C-26），25.9（C-27），12.5（C-28），18.3（C-29），170.7（C-1'），20.5（C-2'）。上述數(shù)據(jù)與Zhu 等［14］報(bào)道基本一致，故鑒定化合物2為helvolinic acid。

化合物3：無(wú)色晶體，ESI-MSm/z：223.2［M+H］+，分子式為C15H26O；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：1.29～1.71（2H， m， H-2），4.24（1H， t，J=7.7 Hz，H-3），5.46（1H， m， H-5），1.83（1H， m， H-6），1.31（1H， m， H-7），1.45～1.73（2H， m， H-8），1.07～1.71（2H， m， H-9），1.61（1H， m， H-10）， 1.71（1H，m， H-11）， 0.89（3H， d，J=6.5 Hz， H-12），0.95（3H， d，J=6.5 Hz， H-13），0.87（3H， d，J=7.1 Hz，H-14），1.75（3H， s， H-15）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：46.2（C-1），32.8（C-2）， 69.1（C-3），137.6（C-4），125.6（C-5），36.5（C-6），61.4（C-7），27.5（C-8），30.0（C-9），48.0（C-10）， 31.6（C-11），23.5（C-12），24.0（C-13），14.5（C-14），19.4（C-15）。上述數(shù)據(jù)與Zhu 等［14］報(bào)道基本一致，故鑒定化合物3為tricho-acorenol。

化合物4：黃色油狀液體，ESI-MSm/z：419.1［M-H］-，分子式為C23H29ClO5；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：2.58（3H， s， H-7），10.12（1H， s， H-8），3.33（2H， d，J=7.4 Hz， H-9），5.17（1H， t，J=7.4 Hz，H-10），2.00（2H， m， H-12），2.16（2H， m， H-13），5.44（1H， t，J=7.3 Hz， H-14），4.46 （1H， dd，J=10.3， 6.1 Hz， H-16），2.31～2.45（2H， m， H-17），1.79（3H， s， H-20），1.57（3H， s， H-21），1.16（3H，s， H-22），1.19（3H， s， H-23）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：114.4（C-1）， 139.6（C-2），114.8（C-3），159.4（C-4），116.0（C-5），162.9（C-6），14.6（C-7），195.3（C-8），22.8（C-9），123.4（C-10），135.5（C-11），40.1（C-12），26.7（C-13），128.8（C-14），134.5（C-15），79.1（C-16），40.8（C-17），219.1（C-18），81.8（C-19），16.2（C-20），11.4（C-21），22.2（C-22），24.6（C-23）。上述數(shù)據(jù)與Zhang 等［15］報(bào)道基本一致，故鑒定化合物4為ascofuranone。

化合物5：無(wú)色無(wú)定形粉末，ESI-MSm/z：405.2［M-H］-，分子式為C23H31ClO4；1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：2.60（3H， s， H-7）， 10.14（1H， s， H-8），3.36 （2H， d，J=7.2 Hz， H-9）， 5.26 （1H， t，J=7.2 Hz， H-10），1.84～1.98（2H， m， H-12），1.35～1.42（2H， m， H-13），1.97（1H， m， H-15），1.60～1.83（2H， m， H-16），2.33（2H， m， H-17），2.40（1H， m，H-19），0.56（3H， s， H-20）， 0.86（3H， d，J=6.7 Hz，H-21）， 0.88（3H， d，J= 6.7 Hz， H-22），1.83（3H，s， H-23）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：114.3（C-1），139.6（C-2），113.4（C-3），159.2（C-4），115.9（C-5），163.0（C-6），14.6（C-7），195.2（C-8），22.9（C-9），122.9（C-10），136.8（C-11），33.8（C-12），36.8（C-13），42.4（C-14），37.0（C-15），32.2（C-16），42.4（C-17），216.9（C-18），51.4（C-19），15.6（C-20），15.3（C-21），7.9（C-22），16.6（C-23）。上述數(shù)據(jù)與Singh 等［16］報(bào)道基本一致，故鑒定化合物5為ilicicolin C。

化合物6：黃色無(wú)定形粉末，ESI-MSm/z：371.2［M-H］-，分子式為C23H32O4；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.22（1H， s， H-3），2.46（3H， s， H-7），10.03（1H， s， H-8），3.85（2H， d，J=7.2 Hz， H-9），5.25（1H， t，J=7.3 Hz， H-10），1.90～2.05（2H， m，H-12），1.37～1.45（2H， m， H-13），1.98 （1H， m，H-15），1.63～1.83（2H， m， H-16），2.35（2H， m， H-17），2.40（1H， m， H-19），0.53（3H， s， H-20），0.85（3H， d，J=6.7 Hz， H-21），0.88（3H， d，J=6.8 Hz，H-22），1.79（3H， s， H-23）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：114.1（C-1），141.9（C-2），111.1（C-3），164.6（C-4），113.9（C-5）， 164.9（C-6），18.0（C-7），194.5（C-8），20.6（C-9），123.6（C-10），136.1（C-11），33.8（C-12），36.8（C-13），44.7（C-14），37.0（C-15），32.2（C-16），42.4（C-17），217.0（C-18），51.4（C-19），15.3（C-20），15.7（C-21），7.9（C-22）16.5（C-23）。上述數(shù)據(jù)與Singh等［16］報(bào)道基本一致，故鑒定化合物6為L(zhǎng)L-Z1272?。

化合物7：黃色無(wú)定形粉末，ESI-MSm/z：421.2［M-H］-，分子式為C23H31ClO5；1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：2.58（3H， s， H-7），10.13（1H， s， H-8），3.32（2H， d，J=6.5 Hz， H-9），5.61 （1H， t，J=6.5 Hz，H-10），4.25（1H， dd，J=7.3， 5.1 Hz， H-12），1.46～1.67（2H， m， H-13），2.30（1H， m， H-15），1.57～1.80（2H， m， H-16），2.25（2H， m， H-17），2.53（1H， q，J=6.6， H-19），0.51 （3H， s， H-20），0.98（3H， d，J=6.7 Hz， H-21），0.70（3H， d，J=6.7 Hz，H-22），1.85（3H， s， H-23）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：114.4（C-1），139.9（C-2），114.8（C-3），159.3（C-4），115.0（C-5），162.7（C-6），14.6（C-7），195.4（C-8），22.4（C-9），124.8（C-10），140.1（C-11），75.3（C-12），42.0（C-13），44.9（C-14），37.4（C-15），32.1（C-16），42.5（C-17），216.5（C-18），51.3（C-19），16.2（C-20），15.8（C-21），8.7（C-22），11.3（C-23）。上述數(shù)據(jù)與Seephonkai 等［17］報(bào)道基本一致，故鑒定化合物7為deacetylchloronectrin。

化合物8：黃色無(wú)定形粉末，ESI-MSm/z：624.2［M-H］-，分子式為C31H43ClNO10；1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：2.59（3H， s， H-7），10.13（1H， s， H-8），3.35（2H， m， H-9），5.65（1H， t，J=7.3 Hz， H-10），4.31（1H， dd，J=7.9， 4.4 Hz， H-12），1.62～1.78（2H， m， H-13），2.14（1H， m， H-15），1.50～1.80（2H， m， H-16），2.00（2H， m， H-17），2.48（1H，q，J=6.6， H-19），0.52（3H， s， H-20），1.00（3H，d，J=6.6 Hz， H-21），0.68（3H， d，J= 6.5 Hz， H-22），1.76（3H， s， H-23），4.77 （1H， m， H-1'），3.87（1H， m， H-2'），3.68（1H， m， H-3'），3.55（1H， m，H-4'），3.69（1H， m， H-5'）， 3.70～3.80（2H， m， H-6'），2.02（3H， s， H-2″）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：114.4（C-1），140.0 （C-2），114.5（C-3），159.4（C-4），114.9（C-5），162.6（C-6），14.6（C-7），195.4（C-8），22.5（C-9），129.8（C-10），135.6（C-11），78.7（C-12），40.5（C-13），44.8（C-14），37.2（C-15），32.0（C-16），42.4 （C-17），216.3（C-18），51.4（C-19），16.3（C-20），16.1（C-21），8.7（C-22），11.0（C-23），93.9（C-1'）， 55.2（C-2'），74.5（C-3'），72.5（C-4'），72.6（C-5'），62.8（C-6'），173.5（C-1''），22.6（C-2''）。上述數(shù)據(jù)與Subko 等［18］報(bào)道基本一致，故鑒定化合物8為ascochlorinN-acetylglucosamine。

2.3 煙曲霉酸的含量測(cè)定

2.3.1儀器精密度實(shí)驗(yàn) 5次進(jìn)樣測(cè)定0.3 mg·mL-1煙曲霉酸標(biāo)準(zhǔn)品（圖3A）的峰面積依次為2 158.7、2 171.9、2 153.5、2 169.2 和2 197.4。經(jīng)計(jì)算其RSD=0.8%，表明儀器精密度良好。

圖3 煙曲霉酸產(chǎn)量的測(cè)定Fig. 3 Determination of helvolic acid yield

2.3.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)品濃度X與標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰面積Y之間的回歸方程：Y=6.528 8X+125.5，R2=0.998 4。煙曲霉酸質(zhì)量濃度在0.1～0.5 mg·mL-1內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（圖3B）。

2.3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取0.5 mg·mL-1粗提物溶液（圖3C）在0、2、4、6、8 h 重復(fù)進(jìn)樣測(cè)量的峰面積分別為2 723.2、2 746.3、2 753.3、2 761.3 和2 781.2。RSD 值為0.8%，確認(rèn)樣品溶液在8 h 內(nèi)是基本穩(wěn)定的。

2.3.4重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取5 份0.5 mg·mL-1的粗提物溶液分別進(jìn)樣，其吸收峰面積分別為2 715.2、2 724.9、2 714.7、2 771.1 和2 773.2。RSD 值為1.1%，確認(rèn)此測(cè)定方法具有良好的重復(fù)性。

2.3.5加樣回收試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1粗提物200 μL，分3批加入200 μL 0.2、0.4、0.6 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣檢測(cè)器峰面積，計(jì)算其回收率分別為99.2%、101.4%及102.1%，平均回收率為100.9%，RSD 值為1.5%，表明該測(cè)量方法的可信度較高。

2.3.6煙曲霉酸含量測(cè)定 將各組溶液的峰面積代入上述回歸方程，計(jì)算不同發(fā)酵時(shí)間的煙曲霉酸含量（圖3D）。結(jié)果表明，發(fā)酵6 d后，煙曲霉酸產(chǎn)量顯著升高；發(fā)酵時(shí)間15 d時(shí)，煙曲霉酸的產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到最大值2.98±0.09 g·kg-1。

3 討論

本課題組篩選的真菌Stilbellasp. CGMCC 40422 具有較強(qiáng)的萜類化合物生產(chǎn)能力。使用大米培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵后，獲得了8個(gè)萜類化合物，其中主產(chǎn)物為煙曲霉酸。其中化合物1 和2 為C29原萜烷型四環(huán)三萜，化合物3為倍半萜，化合物4～8為雜萜類化合物。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，1942年首次從煙曲霉菌分離得到煙曲霉酸，因其具有廣泛的生物學(xué)活性而備受關(guān)注。煙曲霉酸屬于梭鏈孢烷抗生素，來(lái)源于真菌，在原萜烯醇（protostadienol）的基礎(chǔ)上經(jīng)C-4β去甲基化、C-16β位乙酰氧化、C-20位甲基氧化成羧基等一系列修飾反應(yīng)形成的四環(huán)三萜類化合物。作為梭鏈孢烷型抗生素的代表，煙曲霉酸具有顯著抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的活性［8］。2017年，姚新生等［19］系統(tǒng)地闡明了煙曲霉酸的生物合成途徑，并測(cè)試了煙曲霉酸及其衍生物helvolinic acid抑制金黃色葡萄球菌的能力，最小抑制濃度（minium inhibitory concentration，MIC）分別為2.0 與0.5 μg·mL-1。Sanmanoch等［20］測(cè)試了煙曲霉酸對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、肺炎鏈球菌等細(xì)菌的抑制活性，最小抑制濃度均在16～32 μg·mL-1。Xiao等［21］發(fā)現(xiàn)煙曲霉酸對(duì)胰腺、肺、肝臟等癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用，在抗癌復(fù)合藥物中有顯著的協(xié)同增效作用。Xu 等［22］報(bào)道該化合物能通過(guò)抑制RANKL 誘導(dǎo)NFATc1 激活來(lái)減弱破骨細(xì)胞的形成和功能，從而抑制骨質(zhì)疏松與骨溶解等疾病。

化合物4～8是一類由苔色酸與15個(gè)碳單位的萜類衍生物法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）酯混合而成的真菌雜萜，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血脂等藥理活性。2019年，日本Abe等［23］闡明了化合物4與5的生物合成途徑。研究表明ascofuranone（化合物4）是藥物開(kāi)發(fā)中治療癌癥、泡球蚴?。ˋlveolar echinococcosis）和非洲錐蟲(chóng)?。ˋfrican trypanosomiasis）的先導(dǎo)化合物。Gutiérrez等［24］報(bào)道ilicicolin C（化合物5）對(duì)豆薯細(xì)菌性葉斑病病原菌Pseudomonas syringae具有抑制作用，IC50值為28.5 mg·mL-1，與鏈霉素和青霉素的活性相當(dāng)。

CGMCC 40422 粗提物的HPLC 分析圖譜顯示，煙曲霉酸的含量最高。通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定煙曲霉酸含量，在培養(yǎng)15 d 后產(chǎn)量達(dá)最大值3 g·kg-1。徐帆等［25］對(duì)來(lái)源于海洋的煙曲霉菌CY018發(fā)酵生產(chǎn)煙曲霉酸的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，最終產(chǎn)量達(dá)54.81 mg·L-1。譚雁鴻等［26］選用軟珊瑚真菌Eupenicilliumsp. DX-SER3 經(jīng)大米培養(yǎng)基發(fā)酵后提取，最終煙曲霉酸的產(chǎn)量為156.25 mg·kg-1。本文研究菌株的煙曲霉酸生產(chǎn)能力遠(yuǎn)高于其他菌株，展現(xiàn)出了強(qiáng)大的萜類化合物生產(chǎn)能力，推測(cè)其萜類天然產(chǎn)物合成的上游途徑（如MVA 途徑）合成能力強(qiáng)，萜類合成前體（如法尼基焦磷酸、2，3-環(huán)氧鯊烯）供應(yīng)充足。此外，CGMCC 40422 能夠高效生產(chǎn)煙曲霉酸等萜類化合物，推測(cè)部分修飾萜類骨架的P450 酶在該菌中表達(dá)能力強(qiáng)。未來(lái)如果能建立穩(wěn)定的遺傳操作系統(tǒng)，則可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為底盤(pán)細(xì)胞，低成本發(fā)酵生產(chǎn)有價(jià)值的萜類化合物如靈芝酸、甘草次酸等。