李潔 , 岳曉禹 , 崔麗偉 , 許文濤,3 , 李相陽
1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102206;
2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物學(xué)院,鄭州 450046;
3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系,北京 100083
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是水產(chǎn)品中常見的食源性致病菌,根據(jù)報(bào)道,其已超過沙門氏菌成為造成細(xì)菌性中毒最主要的微生物[1-2]。副溶血性弧菌屬于革蘭氏陰性菌,作為中等嗜鹽菌,其在1%~9% NaCl 溶液中均可以生長繁殖,最佳生長濃度約為3% NaCl,最佳生長溫度30~35℃,低于4℃時(shí)停止生長,因此在溫暖的海水中優(yōu)先生長。根據(jù)菌體O 型抗原和莢膜K 型抗原的不同,副溶血性弧菌可以分為13種O型和71種K型[3-4]。副溶血性弧菌的爆發(fā)不僅會(huì)使大量的水產(chǎn)動(dòng)物快速死亡,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,還會(huì)使消費(fèi)者因食用被污染的水產(chǎn)品而引起流行性腹瀉,危害消費(fèi)者的身體健康[5-7]。因此,針對副溶血性弧菌篩選核酸適配體對于其快檢技術(shù)的開發(fā)具有重要的意義。
核酸適配體是目前備受關(guān)注的一種識(shí)別元件,通過其特異性識(shí)別可以將靶標(biāo)濃度歸一化為核酸分子,并進(jìn)一步與不同的信號輸出方式結(jié)合實(shí)現(xiàn)快速檢測[8-10]。核酸適配體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)獲得的一段寡核苷酸序列,可以特異性的識(shí)別靶標(biāo)物質(zhì)[11]。1990 年首次被開發(fā),此后的三十多年中多種靶標(biāo)物質(zhì)的適配體陸續(xù)被開發(fā)和應(yīng)用,包括農(nóng)藥、重金屬、抗生素和微生物等[12-13]。
本研究利用cell-SELEX技術(shù)對副溶血性弧菌的適配體進(jìn)行了篩選,并對每輪篩選中的PCR 輪數(shù)和Lambda外切酶使用量進(jìn)行了優(yōu)化,以期為副溶血性弧菌的快速檢測奠定基礎(chǔ)。
1.1.1實(shí)驗(yàn)菌種 實(shí)驗(yàn)使用的副溶血性弧菌ATCC 17802、單增李斯特氏菌CMCC 54002、金黃色葡萄球菌ATCC 29213 和鼠傷寒沙門氏菌CMCC 50115 由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評估(食品)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。
1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 rTaq酶、dNTP、100 bp DNA Marker 和核酸染料購自北京天根生化科技有限公司;西班牙瓊脂糖購自北京沃比森科技有限公司;qPCR Mix購自北京全式金生物科技有限公司;3%氯化鈉堿性蛋白胨水購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司,其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.1.3試劑配制 1×BB 緩沖溶液:稱取1.212 g Tris、0.175 4 g NaCl、0.203 3 g MgCl2·6H2O 溶于150 mL去離子水中,調(diào)至pH 7.5,加入去離子水補(bǔ)足至200 mL。
適配體處理:將合成的適配體粉末于4 ℃ 4 000 r·min-1離心2 min 后加入一定量的超純水得到100 μmol·L-1母液,置于-20 ℃儲(chǔ)存。每次使用前將100 μmol·L-1母液稀釋成相應(yīng)的濃度,置于95 ℃、金屬浴中10 min,冰上立即冷卻10 min以獲得變性的核酸適配體,便于適配體與靶標(biāo)的后續(xù)結(jié)合。
1.1.4實(shí)驗(yàn)儀器 LineGene 9600plus 熒光定量PCR 檢測儀購自杭州博日科技有限公司;A300 基因擴(kuò)增儀購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司;電泳儀購自北京市六一儀器廠;凝膠成像儀購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司;流式細(xì)胞儀購自貝克曼庫爾特有限公司;可調(diào)式混勻儀旋渦混合器購自北京開源國創(chuàng)科技有限公司;氣浴恒溫振蕩儀購自北京得利特科技有限公司;恒溫金屬浴購自北京富德安科技有限公司;CF1524R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購自杭州恒流科技有限公司;Nanodrop 超微量分光光度計(jì)購自賽默飛世爾科技公司。
1.2.1副溶血性弧菌生長曲線測定 取活化好的菌液1 mL 加入含30 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水液體培養(yǎng)基的50 mL 錐形瓶中,37 ℃ 200 r·min-1下培養(yǎng)。每隔1 h 測量一次OD620,繪制生長曲線以確定菌生長的對數(shù)期。選取合適培養(yǎng)時(shí)間的菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。
1.2.2引物退火溫度優(yōu)化 初始文庫由35 個(gè)堿基的核心區(qū)域和兩端各20 個(gè)堿基的引物區(qū)域組成,即5'-ATCCATTGCCACTGACTACC-N10-AGGTTAAGAGGCGCT-N10-GAAGTCAGTCGGTCGTTAGT-3',用于PCR 擴(kuò)增的引物分別為上游引物5'-ATCCATTGCCACTGACTACC-3' ,下游引物5'-ACTAACGACCGACTGACTTC-3',其中下游引物的5'端磷酸化修飾用于單鏈制備。在實(shí)驗(yàn)開始前將引物在55~65 ℃之間進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化,擴(kuò)增后利用4%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。
1.2.3適配體篩選過程 本篩選過程一共為12 輪,包括9 輪正向篩選和3 輪反向篩選,在反向篩選中選擇國標(biāo)中與副溶血性弧菌出現(xiàn)在同一食品中的微生物作為負(fù)篩靶標(biāo),包括金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和單增李斯特菌,負(fù)篩靶標(biāo)的使用可以提高篩選到的適配體特異性。具體篩選中使用的各組分加樣量如表1 所示,在12 輪的篩選中逐漸減小菌液加樣量、減短孵育時(shí)間及增加孵育后洗滌次數(shù)以增加篩選壓力。雙鏈的大量擴(kuò)增使用PCR 方法,單鏈獲得采用Lambda 酶切方法,在每輪擴(kuò)增中對PCR輪數(shù)和Lambda外切酶用量進(jìn)行優(yōu)化。次級文庫純化使用醇沉法。12 輪篩選完成后送測序公司進(jìn)行序列測序并對得到的序列進(jìn)行性能探究,親和力則利用Saika等[15]報(bào)道的方法進(jìn)行計(jì)算。
表1 篩選過程中各組分加樣量及反應(yīng)時(shí)間Table 1 Sample loading and reaction time of each component in the SELEX
在接菌完成后每小時(shí)測量一次OD620以對副溶血性弧菌生長的對數(shù)期進(jìn)行探究。由圖1可知,經(jīng)過1 h 延滯期副溶血性弧菌進(jìn)入快速生長階段,選擇培養(yǎng)5 h 的菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)得到此時(shí)菌落總數(shù)約為109CFU·mL-1,適合用于適配體篩選,因此選用5 h 作為后續(xù)菌液的培養(yǎng)時(shí)間。
圖1 副溶血性弧菌的生長曲線Fig. 1 Growth curve of Vibrio parahaemolyticus
合適的退火溫度有利于質(zhì)量更高的PCR產(chǎn)物產(chǎn)生[16]。在55~65 ℃之間進(jìn)行退火溫度優(yōu)化,由圖2 可知,隨著退火溫度的不斷升高非特異性產(chǎn)物條帶(圖2 中75 bp 產(chǎn)物以外部分)越來越明亮,因此選擇55 ℃作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的退火溫度。
圖2 退火溫度優(yōu)化結(jié)果Fig. 2 Results of annealing temperature optimization
隨著篩選中PCR 擴(kuò)增產(chǎn)生的偏差和Lambda外切酶在單鏈生產(chǎn)中發(fā)生的切割偏差,PCR 過程中會(huì)產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物,因此每輪擴(kuò)增中需對PCR輪數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,以第4輪篩選的PCR優(yōu)化為例,隨著擴(kuò)增輪數(shù)的增加,非特異性產(chǎn)物越來越多,如果擴(kuò)增輪數(shù)過少則不能產(chǎn)生足夠的目標(biāo)產(chǎn)物,因此,在第4 輪中選擇28 輪作為擴(kuò)增輪數(shù)(圖3)。PCR 產(chǎn)物的不同則需要不同的Lambda 外切酶用量,酶切時(shí)間過長和酶量使用過多都會(huì)造成目標(biāo)序列的損失,而酶切時(shí)間過短和酶量使用過少則會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)單鏈的產(chǎn)量不足,難以有效構(gòu)建次級文庫。以第3輪篩選的酶切優(yōu)化為例,在45 μL雙鏈產(chǎn)物中加入0.8、1.0、1.2、1.5和2 μL Lambda外切酶和5 μL緩沖液,結(jié)果如圖4 所示,0.8 μL 產(chǎn)生的單鏈最多。
圖3 第4輪篩選PCR輪數(shù)優(yōu)化結(jié)果Fig. 3 Results of PCR cycle optimization in fourth round of SELEX
圖4 第3輪篩選Lambda外酶切優(yōu)化結(jié)果Fig. 4 Results of Lambda exonuclease enzyme optimization in third round of SELEX
經(jīng)過12輪的篩選后進(jìn)行測序及同源性分析,從中初選了10條序列進(jìn)行qPCR,當(dāng)適配體與靶標(biāo)菌具有較好的結(jié)合效果時(shí),同樣的菌數(shù)可以結(jié)合更多的適配體數(shù)量,因此產(chǎn)生更小的Ct值,由圖5可知,F(xiàn)-3-2和F-28-10在10條序列中更好的結(jié)合效果。
圖5 10條候選適配體序列的qPCR結(jié)果Fig. 5 Results of qPCR for 10 candidate aptamer sequences
利用流式細(xì)胞術(shù)對這2 條序列進(jìn)行適配體結(jié)合效果和特異性的進(jìn)一步探索。如圖6所示,2條適配體均表現(xiàn)了較好的特異性,其中F-28-10特異性表現(xiàn)更佳。由圖7 陰性菌和適配體孵育后的菌體熒光對比可知,2 條適配體均具有較好的結(jié)合能力且F-28-10 表現(xiàn)更佳。因此,F(xiàn)-28-10 為篩選得到的效果最佳的適配體,序列為5'-ATCCATT GCCACTGACTACCAATATCACGTAGGTTAAGAGGC GCTCTCCCACCAAGAAGTCAGTCGGTCGTTAGT-3'。
圖6 適配體與細(xì)菌結(jié)合的流式細(xì)胞術(shù)分析Fig. 6 Flow cytometric analysis of aptamers binding to bacteria
圖7 適配體F-3-2和F-28-10結(jié)合效果對比Fig. 7 Comparison of binding effects of aptamers F-3-2 and F-28-10
進(jìn)一步對F-28-10 的親和力進(jìn)行研究,適配體濃度按100~10-4nmol·L-1梯度對F-28-10 做標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖8),獲得了用于適配體結(jié)合濃度計(jì)算的回歸方程y=(8.89±0.30)-(3.73±0.14)x(R2=0.995)。固定副溶血性弧菌濃度,增加適配體濃度獲得適配體-靶標(biāo)解離飽和曲線。將1、10、50、100、200 nmol·L-1濃度的適配體序列與靶標(biāo)孵育,qPCR 后計(jì)算結(jié)合濃度獲得了解離飽和曲線(圖9)。Kd值越低證明適配體與靶標(biāo)結(jié)合越好,利用Origin 軟件擬合得到F-28-10 的Kd值為44.31±31.46 nmol·L-1。
圖8 適配體F-28-10的親和力研究Fig. 8 Affinity study of aptamer F-28-10
圖9 F-28-10與副溶血性弧菌的結(jié)合解離曲線Fig. 9 Dissociation saturation curves of F-28-10 and Vibrio parahaemolyticus
自1950 年首次在日本被發(fā)現(xiàn),副溶血性弧菌就成為了全球性的衛(wèi)生安全問題,并隨著我國居民生活水平提升和水產(chǎn)品消費(fèi)量的不斷增長成為我國細(xì)菌性中毒事件發(fā)生的首要原因。在合適的條件下副溶血性弧菌將在3~4 h 內(nèi)快速生長[17],因此用于副溶血性弧菌檢測的適配體傳感器的開發(fā)近年來受到廣泛關(guān)注[18-19],然而相比于大腸桿菌等其他常見食源性致病菌,副溶血性弧菌適配體篩選的數(shù)量較少,因此本研究通過在12 輪的篩選中逐漸增加篩選壓力,并對每輪PCR 擴(kuò)增輪數(shù)和Lambda外切酶用量進(jìn)行優(yōu)化,同時(shí)在測序后通過qPCR 和流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)驗(yàn)證分析得到了一條在特異性和結(jié)合能力方面表現(xiàn)最佳的適配體序列F-28-10,研究結(jié)果豐富了副溶血性弧菌在適配體傳感器開發(fā)中識(shí)別元件的選擇。