巫 蓉 趙汗青 王文娟

(首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院/中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室,北京,100069)

據(jù)國際癌癥研究所的統(tǒng)計,世界范圍內(nèi)各種癌癥將從2012年的1 400萬人增加到2025年的1 900萬人,到2035年預(yù)計將達到2 400萬人,而近幾年癌癥在中國是主要致死原因,且新增病例數(shù)最多[1-2]?；熢跉⑺滥[瘤細胞的同時也會造成人體正常細胞的損傷。一般來說,損傷DNA的化療引發(fā)骨髓抑制的作用最強,而損傷RNA的化療次之,影響蛋白合成者最小[3-6]?；煂?dǎo)致造血干細胞活性下降,表現(xiàn)為以白細胞下降為主的外周血全血細胞減少。

骨髓抑制的中醫(yī)病機不外乎脾腎兩虛、氣血不足、瘀血搏結(jié)。若邪毒傷腎,腎精虧損,精不養(yǎng)髓,髓不化血則可致血液虧少[7]。臨床研究顯示骨髓抑制從腎論治,以扶正作為治療大法,具有很好的療效[8]。實驗研究證實,補腎中藥可以改善外周血象,促進骨髓造血干/祖細胞增殖分化,減少骨髓細胞凋亡,促進造血生長因子及其調(diào)控基因表達,改善骨髓造血微環(huán)境等[9-11]。

為進一步探討補腎中藥對骨髓造血支持細胞的影響,本研究采用順鉑致小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow Stem Cell,BMSC)損傷為實驗?zāi)Ｐ?以補腎生血藥進行干預(yù),通過檢測細胞凋亡率、細胞周期、造血調(diào)控因子含量,明確補腎生血藥對化療后BMSC的影響,為臨床“從腎論治”化療后骨髓抑制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(250±20)g雄性SD大鼠50只[許可證號SCXK(京)2016-0011],SPF級(20±2)g雄性BALB/c小鼠8只[許可證號：SCXK(京)2016-0006],由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學實驗動物中心國家標準實驗室。所有動物實驗均經(jīng)首都醫(yī)科大學動物倫理委員會批準(倫理審批號：AEEI-2018-054)。

1.1.2 藥物 補腎生血藥[北京康仁堂藥業(yè)有限公司,各中藥(批號)：熟地黃(18002151),炒山藥(18007841),枸杞子(18008012),山茱萸(17025331),川牛膝(18001591),菟絲子(18007002),鹿角膠(17025581),龜甲(18007921),生黃芪(18005751),當歸(18003261)];順鉑(美國APExBIO,美國,批號：A8321)。

1.1.3 試劑與儀器 Cell Counting Kit-8試劑盒(日本同仁,批號：FH783);AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒,細胞周期檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,批號：20180416);小鼠腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)、γ干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)、干細胞因子(Stem Cell Factor,SCF)、白細胞介素-3(Interleukin-3,IL-3)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte Macrophage Colony-stimulating Factor,GM-CSF);酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測試劑盒(北京金?？朴缟锟萍及l(fā)展有限公司,批號：20190901);流式細胞儀(BD公司,美國,型號：BD LSRFortessa定制型);酶標儀(上?？迫A生物工程股份有限公司,型號：ST-360)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠含藥血清的制備：將SD大鼠隨機分為2組：空白對照組、補腎生血藥組,每組25只?？瞻讓φ战M每日按1 mL/100 g質(zhì)量給予蒸餾水,補腎生血藥組每日按1 mL/100 g質(zhì)量給予相應(yīng)藥液,連續(xù)5天。于第5天給藥1～2 h內(nèi)由腹主動脈取血。室溫靜置2 h后,離心半徑10 cm,1 000 r/min,4 ℃離心20 min,收集血清,同組混勻,56 ℃水浴滅活30 min,經(jīng)0.22 μm濾膜抽濾除菌,2 mL凍存管分裝,-80 ℃保存。

BMSC原代培養(yǎng)與分組：將小鼠用CO2麻醉后處死,浸泡于乙醇中。用剪刀剪開小鼠背部,將小鼠雙下肢皮肉分離取出,浸泡于生理鹽水中,移入細胞間。用剪刀和鑷子分離肌肉和股骨、脛骨,將骨置于5 mL含20%胎牛血清的α最小基本培養(yǎng)基(Alpha Minimum Essential Medium,αMEM)完全培養(yǎng)基中,剪開骨兩端暴露骨髓腔,用1 mL針管吸取培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔至骨髓發(fā)白。吹打細胞混勻,制成骨髓細胞懸液。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后半棄液,加入2 mL含10%胎牛血清的αMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),2～3 d換液1次,至第7天細胞密度達到80%左右傳代。3～5 d傳代1次,傳至第3～4代時凍存部分細胞,其余細胞用于開展后續(xù)實驗。

1.2.2 給藥方法 取處于對數(shù)生長期的BMSC,調(diào)整細胞密度,將細胞按106/mL濃度接種至6孔板,各孔均加入等量αMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素)培養(yǎng)2 d至貼壁,吸除培養(yǎng)液,用磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)清洗各孔。施加各干預(yù)措施,于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h后收獲細胞。

1.2.3 CCK-8檢測順鉑、補腎生血血清對細胞增殖活性的影響 取對數(shù)生長期BMSC,調(diào)整細胞濃度為5×105,按每孔100 μL接種于96孔板中。分別加入25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L順鉑培養(yǎng)液,0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%補腎生血血清,同時設(shè)置空白對照組,每組3個復(fù)孔,于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,向每孔加入10 μLCCK-8溶液,于培養(yǎng)箱中孵育2 h,酶標儀450 nm波長處測定OD值。

1.2.4 流式細胞儀檢測骨髓細胞周期和細胞凋亡率 取對數(shù)生長期的BMSC,調(diào)整細胞密度為5×105,將細胞按2 mL/孔接種于6孔板中進行分組及干預(yù)。干預(yù)48 h后,沖洗消化成細胞懸液,離心半徑10 cm,1 000 r/min,離心5 min去上清液。用Cell Staining Buffer清洗2次,再用PBS緩沖液清洗后離心去上清。加入1 mL Cell Staining Buffer重懸細胞,尼龍布濾膜過濾移至流式管中,于流式細胞儀上檢測細胞周期。

同樣方法收集細胞后加入500 μL Binding Buffer混勻,加入5 μL Annexin V-FITC混勻,再加入5 μL碘化丙啶染色(Propidium Iodide,PI)混勻,室溫避光反應(yīng)5～15 min后于流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。

1.2.5 培養(yǎng)液中造血調(diào)控因子含量檢測 細胞培養(yǎng)后接種至孔板,每孔2 mL,空白組用培養(yǎng)基1.8 mL加空白血清0.2 mL,模型組用順鉑培養(yǎng)基1.8 mL加空白血清0.2 mL,補腎生血組用順鉑培養(yǎng)基1.8 mL加補腎生血血清0.2 mL。各組細胞按上述方法培養(yǎng)48 h后收集細胞,離心半徑10 cm,1 000 r/min,離心5 min收集上清液。酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒分別檢測上清液中TNF-α、TGF-β、IFN-γ、SCF、IL-3、GM-CSF含量。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度順鉑作用和不同濃度補腎生血血清作用48 h的OD值及細胞增殖率 作用48 h后,25 μmol/L順鉑能抑制BMSC的細胞增殖活性(P>0.05),50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L順鉑能顯著抑制BMSC的細胞增殖活性(均P<0.001)。見圖1。其中順鉑濃度為50 μmol/L時細胞增殖率降至50%～60%,因此將順鉑的用藥濃度定為50 μmol/L。

圖1 不同濃度順鉑作用48 h的OD值及細胞增殖率

作用48 h后,5%和10%補腎生血血清能明顯增加細胞增殖活性(均P<0.01),7.5%補腎生血血清能顯著增加細胞增殖活性(P<0.001)。見圖2。因此,將補腎生血血清的用藥濃度定為7.5%。

圖2 不同濃度補腎生血血清作用48 h的OD值及細胞增殖率

2.2 各組TNF-α、TGF-β、IFN-γ、SCF、IL-3、GM-CSF含量比較 與空白對照組比較,模型對照組TNF-α、TGF-β、IFN-γ含量均顯著升高(均P<0.05),SCF、IL-3、GM-CSF含量均顯著降低(均P<0.05);與模型對照組比較,補腎生血血清組TNF-α、TGF-β、IFN-γ含量均顯著降低(均P<0.05),IL-3含量明顯升高(P<0.01)。見圖3。

圖3 細胞培養(yǎng)液中TNF-α、TGF-β、IFN-γ、SCF、IL-3、GM-CSF含量

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率和細胞周期 與空白對照組比較,模型對照組各期細胞比例無明顯變化(均P>0.05);與空白對照組、模型對照組比較,補腎生血血清組處于G1期的細胞比例顯著降低(均P<0.05),處于增殖期的細胞比例顯著增加(均P<0.05);補腎生血血清組較空白對照組處于S期的細胞比例顯著增加(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組流式細胞周期

順鉑作用48 h后,細胞凋亡率明顯升高(P<0.01),補腎生血血清組骨髓細胞凋亡率明顯降低(P<0.001)。見圖5。

圖5 各組流式細胞凋亡率(%)

3 討論

補腎生血藥由當歸補血湯與左歸丸組成。當歸補血湯出自“金元四大家”之一李杲的《內(nèi)外傷辨惑論》,為補益氣血的代表方,功用在于補氣生血,當歸專能補血,陰中之陰,配合補益肺脾之氣的黃芪,氣旺則助血化生。黃芪用量5倍于當歸,一則血虛陽浮,氣不足則難以固里,陽氣外亡,故而重用黃芪補氣而專固肌表;再者有形之血不能速生,并生于無形之氣,補氣即為生血,氣血相生,虛熱自退,即《黃帝內(nèi)經(jīng)》所謂“陽生陰長”。左歸丸見于《景岳全書》卷五十一,原文記載由熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞子、鹿角膠、龜甲膠、川牛膝、菟絲子組成。主要功用在于滋陰補腎,填精益髓。針對真陰不足證,重用熟地黃為君,大補真陰;山藥之補脾,山茱萸之補肝,補肝陰以助腎陰,化生肝血,兼有通利之性,流通血脈之功;合以補腎精之枸杞子,協(xié)助峻補精髓,督任之元,配合血肉有情之品側(cè)重補腎陽的鹿角膠和側(cè)重補腎陰的龜甲膠。全方在補陰之中配伍補陽藥,取“陽中求陰”之義。以上山藥、山茱萸、枸杞子、鹿角膠和龜甲均為臣藥,后加有補腎中之氣的菟絲子,以及補血益肝腎、強腰膝、健筋骨的川牛膝,二者為佐藥,進一步加強補腎益精的功效。方名雖曰左歸,由方解可見實為三陰并補,水火交濟之方,尤以滋補腎陰為主。

現(xiàn)代藥理研究表明,當歸補血湯中已知成分如當歸多糖、阿魏酸、黃芪多糖、黃芪異黃酮和黃芪皂苷均直接或間接參與了血細胞的生成,能夠多環(huán)節(jié)來促進實驗動物造血細胞增殖分化;還一定程度提高化療后患者的免疫力,最終改善患者的骨髓抑制[12]?，F(xiàn)代臨床研究顯示：左歸丸常用于治療再生障礙性貧血及腫瘤放化療反應(yīng),能明顯升高腫瘤放化療患者外周血白細胞數(shù)[13]。

造血因子分為造血生長因子、造血抑制因子。常見造血生長因子包括SCF、IL-3、GM-CSF等。研究報道,化療可影響骨髓造血微環(huán)境,抑制SCF、IL-3、GM-CSF等造血生長因子分泌,從而抑制造血細胞增殖、分化[14],SCF所作用的靶細胞是極早期的、具有多向分化潛能的造血干細胞,促使這類細胞由靜止的、休眠狀態(tài)進入細胞周期或加快細胞周期的進程[15]。IL-3主要作用于早、中期造血祖細胞的增殖和分化,可刺激多種骨髓細胞生長和分化[16]。GM-CSF與GM-CSF受體結(jié)合后促進多種造血細胞增殖分化。GM-CSF主要起到維持粒-單系細胞的存活,促進生長和誘導(dǎo)分化的作用[17]。常見造血抑制因子包括TNF-α、IFN-γ、TGF-β等。作為造血抑制因子之一的TNF家族,主要有TNF-α和TNF-β,二者對干細胞和祖細胞的作用在不同的集落刺激因子刺激下各不相同[18]。TNF-α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在調(diào)節(jié)成人造血功能方面也有報道[19]。IFN-γ是免疫介導(dǎo)的負性造血調(diào)控因子,其可抑制正常骨髓細胞分化、增殖,對造血干細胞生長也具有抑制作用[20]。體外實驗研究發(fā)現(xiàn),骨髓中的IFN-γ還可抑制人和鼠骨髓長期培養(yǎng)的原始細胞活性[21]。

本實驗采用順鉑損傷的小鼠BMSC為模型,以補腎生血藥進行干預(yù),觀察補腎生血血清對BMSC凋亡、細胞周期及造血調(diào)控因子的影響。干預(yù)48 h后BMSC凋亡率明顯增高(P<0.01),SCF、IL-3、GM-CSF含量均顯著降低(均P<0.05),TNF-α、TGF-β、IFN-γ顯著升高(均P<0.05)。該結(jié)果與文獻[22-23]報道相似,提示化療可造成骨髓細胞凋亡,造血微環(huán)境受到一定的破壞。

根據(jù)中醫(yī)“腎精化血”“腎生髓,髓養(yǎng)血”理論,結(jié)合骨髓抑制的臨床表現(xiàn),本課題組認為化療后骨髓抑制的基本病機為“腎虛髓損、精血虧虛”,因此除健脾養(yǎng)血、補氣生血等常規(guī)治療外,還應(yīng)重視從腎論治[24-25]。本研究結(jié)果顯示,補腎生血血清組骨髓細胞凋亡率明顯降低,G1期細胞比例顯著降低,增殖期細胞比例顯著增加,IL-3含量明顯升高,TNF-α、TGF-β、IFN-γ含量顯著降低。發(fā)現(xiàn)補腎生血血清可減輕化療造成的骨髓細胞凋亡,促進細胞增殖,能促進造血生長因子分泌,并減少造血抑制因子分泌,提示補腎生血藥對改善化療后骨髓抑制具有一定的作用。但由于化療藥的不同,以及造血環(huán)境的復(fù)雜性,可能不同的化療藥對于造血因子有不同的調(diào)控作用,具體情況有待進一步研究。此外,由于補腎生血血清的成分較復(fù)雜,今后還需要進一步開展血清藥理實驗,以明確是補腎生血藥發(fā)揮的藥效作用,還是與血清的協(xié)同作用。

利益沖突聲明：無。