徐春麗 張曉陽 顧宏偉 高建忠

(1 南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,南京,210014; 2 山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,太原,030013)

胃癌是全球常見的惡性腫瘤之一,我國是胃癌高發(fā)國家,發(fā)病率和死亡率均約占全球的50%[1]。目前胃癌的治療主要以手術(shù)聯(lián)合化療為主,根治性手術(shù)可以切除原發(fā)病灶,但在術(shù)后有較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率,且大多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期,失去手術(shù)機(jī)會(huì);術(shù)后輔助放化療,可控制微轉(zhuǎn)移病灶,但會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)和耐藥性,而中醫(yī)藥在抑制胃癌、減輕化療不良反應(yīng)方面具有一定的優(yōu)勢[2],因此,尋求有效的中醫(yī)藥治療成為目前研究的熱點(diǎn)。

基于此,在當(dāng)代醫(yī)家主張的病因病機(jī)的基礎(chǔ)上,高建忠教授以保和消積方治療胃癌,經(jīng)多年臨床實(shí)踐驗(yàn)證,療效良好。保和消積方能取得良好的臨床療效得益于該方以保和丸為底方,所加藥物(三棱、莪術(shù)、白花蛇舌草)更能消癌散結(jié)。該方重用焦山楂消食化積;二陳湯主治痰濕;白花蛇舌草清熱解毒,消癰散結(jié)[3];三棱、莪術(shù)相須而用,破血行氣,消積止痛,增強(qiáng)破血消瘤止痛之功[4]。但目前關(guān)于保和消積方對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移的影響及其可能的作用機(jī)制研究較少。

微血管形成與胃癌細(xì)胞生長與轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系,血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)為促血管生長因子,能誘導(dǎo)新生血管形成[5],還有磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin,mTOR)信號(hào)通路與惡性腫瘤的相關(guān)性成為研究熱點(diǎn),PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路與胃癌密切相關(guān)[6],該信號(hào)通路激活可維持細(xì)胞存活,是腫瘤細(xì)胞抵抗凋亡的重要機(jī)制之一[7],但關(guān)于其在保和消積方治療胃癌中的作用少見報(bào)道。本研究將通過觀察保和消積方對(duì)體外胃癌SGC-7901細(xì)胞株生長增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移能力的影響,并通過觀察保和消積方對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞微管生成和血管內(nèi)皮生長因子的影響,探討保和消積方抑制胃癌細(xì)胞的效果,并基于PI3K-AKT-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析其作用機(jī)制,為胃癌的治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 胃癌SGC-7901細(xì)胞株購自璟源生物科技有限公司(批號(hào)：C6795),培養(yǎng)于添加10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS,Thermo Fisher Scientifc公司,美國,批號(hào)：SH30084.02)、100 U/mL青霉素(河南仟德藥業(yè)有限公司,批號(hào)：130437-201707)和鏈霉素(深圳市貝爾醫(yī)藥科技有限公司,批號(hào)：130308-201514)的RPMI-1640培養(yǎng)液中,并置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),用含乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA)的0.25%胰蛋白酶消化傳代種板,放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過。

1.1.2 藥物 保和消積方中藥購自南京中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房(批號(hào)：684339),保和消積方的配方為：焦山楂30 g、姜半夏9 g、陳皮9 g、茯苓9 g、三棱9 g、莪術(shù)9 g、白花蛇舌草30 g。加水浸泡30 min,煎成60 mg/L的濃縮浸膏,濾網(wǎng)過濾除菌后,分裝放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)液(Corning公司,美國,批號(hào)：WH0021F221),p-PI3K(貨號(hào)：20583-1-AP)、p-AKT(貨號(hào)：60203-2-lg)、p-mTOR(貨號(hào)：20657-1-AP)抗體購自美國Proteintech公司,噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide,MTT]細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,批號(hào)：BJ-S963550),膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào)：C1062M),PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒(Takara公司,日本,批號(hào)：RR037Q),ChamQ SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,批號(hào)：Q311-02)。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司,美國,批號(hào)：320),倒置光學(xué)顯微鏡多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司,美國型號(hào)：Molecular Devices SpectraMax M3),全自動(dòng)高速流式細(xì)胞儀(BD公司,美國,型號(hào)：BD FACSCalibur),高速離心機(jī)(Hettich公司,德國,型號(hào)：MIKRO220R),生物安全柜(AIRTECH公司,型號(hào)：BSC-1004IIA2),細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Inno-Alliance Biotech公司,美國,型號(hào)：Countstar IC 1000)。

1.2 方法

1.2.1 分組 根據(jù)保和消積方的關(guān)鍵成分三棱、莪術(shù)實(shí)驗(yàn)計(jì)量濃度[8],設(shè)置不同質(zhì)量濃度(0.5、1、2、4、8、12、16 mg/mL)的保和消積方稀釋液組作為觀察組,同時(shí)另設(shè)空白對(duì)照組不做藥物處理。

1.2.2 給藥方法 收集處于對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901胃癌細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)內(nèi)容調(diào)整細(xì)胞濃度,種板至相應(yīng)孔板中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。次日,向各孔中加入不同質(zhì)量濃度(0.5、1、2、4、8、12、16 mg/mL)的保和消積方稀釋液,另設(shè)空白對(duì)照組,根據(jù)下述實(shí)驗(yàn)需要分別孵育24 h,48 h及72 h。孵育完成后,根據(jù)后續(xù)試驗(yàn)要求進(jìn)行檢測。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 細(xì)胞MTT試驗(yàn) 收集處于對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901胃癌細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度,使用96孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每孔加入100 μL細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度約為2 000個(gè)/孔。于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育,過夜培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后,根據(jù)健脾養(yǎng)胃方的關(guān)鍵成分三棱、莪術(shù)實(shí)驗(yàn)計(jì)量濃度[8],設(shè)置加入不同質(zhì)量濃度(0.5、1、2、4、8、12、16 mg/mL)的保和消積方稀釋液,另設(shè)空白對(duì)照組,孵育后,在倒置顯微鏡下觀察。然后,每孔加入10 μL MTT溶液(質(zhì)量濃度為5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄掉上清液,加入150 μL二甲基亞砜(Methyl Sulfoxide,DMSO),置于搖床上振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。分別在24 h、48 h、72 h在酶聯(lián)免疫檢測儀上于570 nm處測量各孔的吸光度。

細(xì)胞生長抑制率=(1-觀察組吸光度/空白對(duì)照組吸光度)×100%。

1.2.3.2 細(xì)胞Transwell遷移試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前至少2 h,用培養(yǎng)液完全浸泡Transwell上下室。提前饑餓細(xì)胞12 h,去除血清影響;消化細(xì)胞,中止消化后離心棄去培養(yǎng)液;磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)洗2次,以充分去除血清;用含牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至5×105個(gè)/mL。取細(xì)胞懸液100 μL加入Transwell小室。24孔板下室加入500 μL含20%FBS的培養(yǎng)基,注意：下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生,一旦產(chǎn)生氣泡,下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了,在種板的時(shí)候要特別留心,一旦出現(xiàn)氣泡,要將小室提起,去除氣泡,再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板,培養(yǎng)12～24 h,取出Transwell小室,棄去孔中培養(yǎng)液,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞,PBS洗2次,甲醇固定30 min,將小室適當(dāng)風(fēng)干,0.1%結(jié)晶紫染色20 min,PBS洗3次,倒置顯微鏡下隨機(jī)4個(gè)視野觀察細(xì)胞、記數(shù)和拍照。

1.2.3.3 細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測 取對(duì)數(shù)生長期的胃癌SGC-7901細(xì)胞,接種到6孔板(5×105個(gè)/孔),每孔2 mL培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h后,加入不同質(zhì)量濃度的保和消積方稀釋液處理細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞,把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至1個(gè)合適的離心管內(nèi),PBS洗滌貼壁細(xì)胞1次,加入適量胰酶細(xì)胞消化液(無EDTA)消化細(xì)胞。1 000×g,離心5 min,棄上清液,收集細(xì)胞,用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù),1 000×g,離心5 min,棄上清液,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/mL,加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻,加入10 μL碘化丙啶染色液,輕輕混勻,室溫(20～25 ℃)避光孵育10～20 min,孵育過程中重懸細(xì)胞2～3次以增強(qiáng)染色效果,隨后置于冰浴中,使用鋁箔進(jìn)行避光。立即上機(jī)用流式細(xì)胞儀檢測,Annexin V-FITC為綠色熒光,碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色為紅色熒光。

1.2.3.4 定量PCR檢測AKT、mTOR、PI3K、VEGF的mRNA表達(dá) 各組細(xì)胞處理24 h,TRIzol法提取總mRNA,用焦碳酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate,DEPC)水溶解總mRNA。然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作,依次經(jīng)過去除基因組DNA反應(yīng)、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR,擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性：95 ℃、10 min。擴(kuò)增：95 ℃ 5 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct法計(jì)算目的基因AKT、mTOR、PI3K、VEGF的mRNA含量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3.5 微管形成試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前將無菌槍頭、無菌EP管提前放入4 ℃冰箱預(yù)冷;從-20 ℃冰箱中取出Matragel基質(zhì)膠提前4 ℃解凍,與無血清培養(yǎng)基按照1∶1比例稀釋;在冰上鋪膠,每孔加入200 μL Matragel基質(zhì)膠,避免產(chǎn)生氣泡;鋪膠后將48孔板在4 ℃冰箱內(nèi)放置10 min,在培養(yǎng)箱中孵育30 min,使之成為小管形成培養(yǎng)基,將SGC-7901細(xì)胞消化、離心后,取SGC-7901細(xì)胞上清重懸細(xì)胞;然后每孔加入200 μL細(xì)胞懸液,在恒溫CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后,在倒置顯微鏡下觀察微管形成結(jié)果。每組設(shè)3個(gè)副孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次;在100倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照,并計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.3.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)水平 提取經(jīng)含有不同濃度(0、0.5、1、2、4、8、12、16 mg/L)保和消積方處理的SGC-7901細(xì)胞,24 h后收集SGC-7901細(xì)胞并用放射免疫沉淀(Radio-Immunoprecipitation Assay,RIPA)裂解液冰上裂解30 min,離心30 min(8 000×g,4 ℃),取上清液獲得蛋白樣品,用二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)定量試劑盒定量并計(jì)算蛋白的含量。采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì),用半干轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,使用一抗快速封閉液封閉30 min,一抗的比例分別為p-PI3K(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000)、VEGF(1∶1 000),用聚對(duì)苯二甲酸丁二酯(Poly Butylene Terephthalate,PBT)洗膜3次,放置4 ℃孵育過夜,PBT洗膜3次,放入二抗中室溫下孵育1 h,用PBT洗膜3次,加入超敏化學(xué)發(fā)光(Efficient Chemiluminescence,ECL)發(fā)光顯色,浸潤聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜,用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,組間兩兩比較采用Duncan法比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 保和消積方對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞MTT法分析結(jié)果表明,隨著保和消積方質(zhì)量濃度的增加,SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率呈現(xiàn)線性增加,當(dāng)保和消積方質(zhì)量濃度為16 mg/mL時(shí),藥物對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制率接近100%,達(dá)到閾值。在同一濃度下,隨著藥物處理時(shí)間的延長,保和消積方對(duì)SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率增加。與空白對(duì)照組比較,保和消積方分別在同一時(shí)間下各觀察組的SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率均呈現(xiàn)極顯著升高(均P<0.01)。見圖1。

圖1 不同保和消積方對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 保和消積方對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移的影響 細(xì)胞Transwell遷移試驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,隨著保和消積方質(zhì)量濃度的增加,SGC-7901細(xì)胞遷移的細(xì)胞數(shù)量顯著減少(均P<0.05)。見圖2～3。

圖2 不同濃度保和消積方對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞遷移的抑制作用

圖3 各組胃癌SGC-7901細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)

2.3 保和消積方對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測SGC-7901細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,保和消積方處理組的SGC-7901細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率均有所增加,且隨著保和消積方質(zhì)量濃度的增加而增加,當(dāng)保和消積方質(zhì)量濃度為12 mg/mL時(shí),早期的凋亡率最高,達(dá)到23.66%;當(dāng)保和消積方質(zhì)量濃度為16 mg/mL時(shí),晚期的凋亡率最高,達(dá)到54.74%。見圖4。

2.4 保和消積方對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的AKT、mTOR、PI3K、VEGFmRNA表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較,隨著保和消積方濃度的增加,SGC-7901細(xì)胞中mTOR、PI3K、VEGFmRNA含量均呈現(xiàn)下降趨勢,AKT mRNA含量先降后升,整體呈現(xiàn)下降趨勢,當(dāng)保和消積方質(zhì)量濃度≥1 mg/mL時(shí)AKT含量顯著下降(P<0.05),其中4 mg/mL組的AKT mRNA表達(dá)量最低;當(dāng)保和消積方質(zhì)量濃度≥0.5 mg/mL時(shí)mTOR含量顯著下降(P<0.05),其中16 mg/mL組的mTOR mRNA表達(dá)量最低;當(dāng)保和消積方質(zhì)量濃度≥2 mg/mL時(shí)PI3K含量顯著下降(P<0.05),其中16 mg/mL組的PI3K mRNA表達(dá)量最低;當(dāng)保和消積方質(zhì)量濃度≥1 mg/mL時(shí)VEGF含量顯著下降(P<0.05),其中16 mg/mL組的VEGF mRNA表達(dá)量最低。見圖5。

圖5 保和消積方對(duì)SGC-7901細(xì)胞AKT、mTOR、PI3K、VEGF的qPCR表達(dá)

2.5 不同濃度保和消積方對(duì)SGC7901細(xì)胞PI3K-AKT-mTOR和VEGF通路的影響 與空白對(duì)照組比較,不同濃度保和消積方(1～16 mg/mL)的胃癌SGC-7901細(xì)胞p-AKT、p-mTOR、p-PI3K和VEGF蛋白表達(dá)水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),并呈現(xiàn)濃度相關(guān)性。見表2。

表2 不同濃度保和消積方對(duì)SGC7901細(xì)胞PI3K-AKT-mTOR和VEGF通路的影響

2.6 保和消積方對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞微管形成的影響 空白對(duì)照組的SGC-7901細(xì)胞在Matrigel膠上已形成良好的管樣結(jié)構(gòu),添加不同濃度的保和消積方后,SGC-7901細(xì)胞管樣結(jié)構(gòu)均受到破壞,隨著保和消積方濃度的增加,SGC-7901細(xì)胞管樣結(jié)構(gòu)越來越少。見圖6。與空白對(duì)照組比較,保和消積方質(zhì)量濃度1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL、12 mg/mL、16 mg/mL管樣結(jié)構(gòu)數(shù)目均顯著減少(均P<0.01),當(dāng)保和消積方質(zhì)量濃度為16 mg/mL時(shí),細(xì)胞管樣結(jié)構(gòu)數(shù)目下降最多,下降85.71%。見圖7。

圖6 不同濃度保和消積方對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞微管形成的抑制作用(多聚甲醛固定,×200)

圖7 不同濃度保和消積方對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901微管生成數(shù)量的影響

3 討論

中醫(yī)治療胃癌,當(dāng)代醫(yī)家多從脾胃虛等致病因素著手,為腫瘤的中醫(yī)藥防治作出了巨大的貢獻(xiàn)。劉沈林教授多年來致力于消化道腫瘤的臨床研究與科研工作,他治療胃癌的經(jīng)驗(yàn)方組成為：炙黃芪、黨參、炒白術(shù)、當(dāng)歸、白芍、半夏、陳皮、三棱、莪術(shù)、白花蛇舌草、炙甘草[9]。保和消積方即為該治法指導(dǎo)下的臨床常用處方,功用健脾益氣,理氣和胃,臨床可顯著改善胃癌患者的生命質(zhì)量,降低腫瘤標(biāo)志物水平,延緩胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[10-11]。

有研究表明中藥可以從抗血管生成方面發(fā)揮獨(dú)特的防治胃癌的作用[8]。自從Folkman提出假說,腫瘤生長和轉(zhuǎn)移依賴血管生成,阻斷血管生成是腫瘤的治療策略,到如今,這個(gè)觀點(diǎn)已得到廣泛認(rèn)可并持續(xù)成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。在胃癌組織中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上關(guān)鍵基因存在異常表達(dá),同時(shí)該信號(hào)通路異常激活與腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān),但從阻斷血管生成和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路兩方面來研究胃癌的報(bào)道較少。本研究采用保和消積方體外培養(yǎng)的胃癌SGC7901細(xì)胞,觀察到保和消積方不僅可通過阻斷血管生成,也可以通過PI3K-AKT-mTOR通路影響胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖、凋亡。

胃癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖、侵襲和遷移能力[12]。研究報(bào)道,保和消積方中多個(gè)單味中藥均有抗腫瘤的功效,陳皮的現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明陳皮中的陳皮多甲氧基黃酮、川陳皮素具有顯著的抗腫瘤效果,半夏提取物對(duì)肉瘤、宮頸癌、肝癌等體外實(shí)驗(yàn)均有抑制作用,臨床報(bào)道半夏在胃癌中也可取得比較好的療效[13-14]。張瑩等[15]發(fā)現(xiàn),三棱-莪術(shù)組方通過降低SGC-7901細(xì)胞移植瘤裸鼠血清環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)、VEGF和重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)的水平從而達(dá)到抑制SGC-7901移植瘤生長的作用。HAO等[16]證實(shí)茯苓可以有效地抑制AKT的磷酸化(Thr308),并通過AKT介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖侵襲和促進(jìn)其凋亡;另有研究報(bào)道,白花蛇舌草在腫瘤治療中具有更好的效果,可降低患者的血清腫瘤標(biāo)志物水平[17]。本研究結(jié)果顯示,保和消積方可以抑制胃癌細(xì)胞系體外的增殖,且對(duì)細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間相關(guān)性和濃度相關(guān)性,進(jìn)一步利用流式細(xì)胞儀檢測胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡率,結(jié)果表明不同濃度保和消積方的胃癌細(xì)胞凋亡率均顯著高于空白對(duì)照組,揭示保和消積方抑制細(xì)胞分裂,促進(jìn)其凋亡,并且其可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而抑制細(xì)胞增殖。

PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路參與調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)功能[18],為了進(jìn)一步探討保和消積方對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的作用機(jī)制,本研究觀察了PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路在其中的作用。機(jī)體在失調(diào)的狀態(tài)下,PI3K會(huì)集中到細(xì)胞膜,促進(jìn)AKT蛋白磷酸化而活化,進(jìn)一步激活下游mTOR,激活的AKT和mTOR通過多種途徑促進(jìn)癌細(xì)胞生存,抑制凋亡的發(fā)生[19]。相關(guān)研究也報(bào)道了PI3K-AKT-mTOR通路可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移,并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[6,20]。另外,通過靶向治療可抑制癌細(xì)胞中PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路及癌細(xì)胞增殖[21]。本研究發(fā)現(xiàn),不同濃度保和消積方均顯著降低了PI3K-AKT-mTOR的mRNA和蛋白表達(dá)水平,濃度越高表達(dá)量越低,揭示保和消積方通過抑制PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化表達(dá),抑制PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路,從而誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡,進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。

另有研究已被證實(shí)VEGF是胃癌細(xì)胞中重要的促血管生成因子[22],它能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移,誘導(dǎo)細(xì)胞脈管形成。陳海姣等[23]發(fā)現(xiàn)巴佛洛霉素A1能夠通過抑制空泡型ATP酶(Vacuolar-type ATPase,V-ATPase)的活性來抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞VEGF的表達(dá)和新生血管的形成,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移。研究證實(shí),健脾養(yǎng)胃方能夠下調(diào)VEGF mRNA水平及蛋白表達(dá),從而抑制胃癌細(xì)胞的血管生成,進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖與遷移[24]。本研究中保和消積方能夠抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞微管的形成，不僅細(xì)胞管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量顯著降低，其血管生成相關(guān)基因VEGF表達(dá)水平也有顯著降低，進(jìn)一步檢測細(xì)胞的Transwell遷移能力，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移能力明顯降低，提示了保和消積方可以通過降低胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞VEGFmRNA的表達(dá)量，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞血管生成和遷移。

綜上所述,保和消積方通過抑制PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路激活,進(jìn)而抑制了細(xì)胞SGC7901增殖,從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡,同時(shí)下調(diào)了VEGFmRNA的表達(dá),降低胃癌細(xì)胞血管生成,進(jìn)而抑制了、胃癌細(xì)胞的增殖與遷移。本研究只是初步探索了保和消積方對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞有明顯的抑制增殖、遷移、血管生成作用,但其具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明,不存在與工作責(zé)任相沖突的任何經(jīng)濟(jì)和非經(jīng)濟(jì)利益,保證該研究的獨(dú)立性和科學(xué)性。