李 玲 劉 楊 夏 凡 張秋瑩 王小波 謝明水

(1 湖北醫(yī)藥學院附屬隨州醫(yī)院,隨州,441300; 2 湖北醫(yī)藥學院附屬隨州醫(yī)院轉化醫(yī)學中心,隨州,441300)

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤,占每年新發(fā)惡性腫瘤的10%以上,嚴重威脅人們的生命健康[1]。傳統(tǒng)治療肺癌的手段包括手術、化療等,而手術治療存在復發(fā)等問題,且很多患者由于發(fā)現較晚,錯過了手術治療的最佳時期[2]。化療藥物如順鉑等雖能抑制腫瘤生長,但是存在不良反應大、耐藥等問題[3]。因此,開發(fā)新的治療肺癌的藥物已成為當今研究的熱點。近年來研究發(fā)現,一些中藥中提取的成分對肺癌具有明顯的抑制作用,姜黃素可通過調控PI3K/AKT/mTOR信號通路,抑制肺癌細胞浸潤與轉移[4],刺五加多糖可通過調控Wnt/β-catenin信號通路,對非小細胞肺癌細胞增殖及轉移發(fā)揮抑制作用[5],靈芝孢子粉及其提取物可通過抑制血管生成,降低肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長[6]。吳茱萸堿是中藥吳茱萸中主要的生物堿類物質,具有一定的抗腫瘤作用,體外實驗發(fā)現吳茱萸堿可促進肺癌細胞凋亡[7]。然而,對吳茱萸堿對肺癌的在體抗腫瘤研究較少[8]。本實驗以Lewis肺癌細胞荷瘤小鼠模型為研究對象,評估吳茱萸堿的在體抗肺癌作用,并從調控血管生成及HIF-1α/VEGF信號通路入手,初步探究吳茱萸堿治療肺癌的在體作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 試劑：吳茱萸堿[分子式：C19H17N3O;分子量：303.36 Da;純度≥98%;化學物質登錄(Chemical Abstracts Service,CAS)號：518-17-2]購自四川維克奇生物科技有限公司;順鉑注射液(規(guī)格10 mg/支)購自齊魯制藥有限公司(批號：8K029A89);羅斯威爾公園紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute,RPMI)1640培養(yǎng)基(貨號：11875119)、胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS,貨號：10100147)、青霉素/鏈霉素(貨號：15140148)、胰酶(貨號：25200072)購自美國Gibco生物有限公司;RNA提取(貨號：DP419)、反轉錄(貨號：KR106-02)、擴增試劑盒(貨號：FP205-02)購自天根生物科技有限公司;免疫組織化學一抗VEGF(貨號：ab1316)、缺氧誘導因子-1α(Hypoxia-inducible Factor-1α,HIF-1α)(貨號：ab1)、CD31(貨號：ab182981)購自英國Abcam生物科技有限公司。儀器：光學顯微鏡(Nikon,日本,型號：ECLIPSE TS100);熒光定量PCR儀(Bio-RAD,美國,型號：iQTM5)。

1.2 小鼠Lewis肺癌細胞體外培養(yǎng) 小鼠Lewis肺癌瘤株購于中國科學院上海生命科學研究院。細胞復蘇時取液氮保存的小鼠Lewis肺癌瘤株37 ℃水浴融化,加入RPMI 1640完全培養(yǎng)液(90%1640培養(yǎng)液+10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素),于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),次日換液,至80%左右融合時用胰酶消化傳代,3 d傳代1次[9]。

1.3 荷瘤小鼠模型的建立 選取40只雄性C57BL/6小鼠,體質量(20.0±2.0)g,購于北京華阜康實驗動物技術有限公司,動物許可證號：SYXK(京)2019-0028。動物級別：無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級別,室溫(22±2)℃,給予無菌飼料及無菌水。將培養(yǎng)后的Lewis細胞用胰蛋白酶消化,調整細胞濃度至約1×107個/mL。充分搖勻瘤細胞懸液,于右腋窩皮下接種瘤細胞懸液0.2 mL,接種后7 d成瘤[10]。該實驗被湖北醫(yī)藥學院附屬隨州醫(yī)院倫理委員會批準(倫理審批號：2020-06)。

1.4 實驗分組及給藥方案 將成瘤后的小鼠平均分為模型對照組、陽性對照組及吳茱萸堿低、高劑量組,每組10只。模型對照組每天灌胃生理鹽水0.2 mL,陽性對照組小鼠于第1、3、5、7、9、11、13天腹腔注射順鉑2 mg/kg,吳茱萸堿低、高劑量組小鼠每天分別灌胃吳茱萸堿10、20 mg/kg,連續(xù)灌胃14 d。

1.5 一般情況觀察 給藥期間第0、3、6、9、12天運用游標卡尺測量各組小鼠腫瘤長徑與短徑,計算腫瘤體積,計算公式為：腫瘤體積(cm2)=腫瘤長徑(cm)×短徑(cm)2/2;給藥14 d后,測量各組小鼠體質量,之后收集分離腫瘤、胸腺、脾組織,稱取各組織重量,計算抑瘤率、胸腺指數及脾指數,抑瘤率計算公式為：抑瘤率(%)=[模型對照組平均瘤重(g)-藥物干預組平均瘤重(g)]/模型對照組平均瘤重(g)×100%;胸腺指數(mg/g)=胸腺重量(mg)/體質量(g),脾指數(mg/g)=脾重量(mg)/體質量(g)。

1.6 定量PCR(Quantitative PCR,qPCR) 運用試劑盒提取小鼠腫瘤組織中的總RNA,逆轉錄合成cDNA。以cDNA作為模板,按照試劑盒說明分別加入引物和SuperReal PreMix Plus等,擴增反應條件：95 ℃ 15 min,95 ℃ 20 s,56 ℃,20 s,40循環(huán)。qPCR儀檢測各組小鼠腫瘤組織中血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)及缺氧誘導因子-1α(Hypoxia-inducible Factor-1α,HIF-1α) mRNA表達,采用β-actin為內參。具體引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 免疫組織化學 將1.5中收集的小鼠腫瘤運用甲醛溶液固定,之后進行脫水、透明、包埋、切片,免疫組織化學染色觀察吳茱萸堿干預后各組小鼠腫瘤組織中VEGF、HIF-1α、血小板-內皮細胞黏附分子(Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1,PECAM-1,CD31)表達情況。一抗稀釋倍數：VEGF(1∶400),HIF-1α(1∶200),CD31(1∶2 000)。光學顯微鏡對腫瘤組織免疫組織化學結果進行拍照,運用Image J軟件對拍照后的圖片中VEGF及TGF-β1陽性表達區(qū)域進行量化,計算出平均光密度。同時在200×視野下隨機選取3個視野,分別計數CD31陽性表達血管數目,取平均值計算組織微血管密度(Microvessel Density,MVD)。

2 結果

2.1 吳茱萸堿對Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長及臟器指數的影響 與模型對照組比較,陽性對照組、吳茱萸堿各給藥劑量組小鼠腫瘤生長顯著減緩,腫瘤體積減小(P<0.05或P<0.01)。見圖1。吳茱萸堿干預14 d后,陽性對照組及吳茱萸堿各給藥劑量組小鼠腫瘤重量顯著減少(P<0.05或P<0.01),抑瘤率分別為53.13%、20.49%、38.54%。臟器指數結果顯示,陽性對照組小鼠胸腺、脾指數較模型對照組比較明顯降低(P<0.05或P<0.01),吳茱萸堿各給藥劑量組胸腺、脾指數與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

圖1 吳茱萸堿干預期間各組小鼠腫瘤生長曲線(n=10)

表2 吳茱萸堿干預14天后各組小鼠腫瘤重量、抑瘤率及臟器指數

2.2 吳茱萸堿對Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織中HIF-1α及VEGF mRNA表達的影響 吳茱萸堿干預14 d后,與模型對照組比較,陽性對照組及吳茱萸堿高劑量組小鼠腫瘤組織中HIF-1α基因表達顯著下調(P<0.01),陽性對照組及吳茱萸堿低、高劑量組小鼠腫瘤組織中VEGF基因表達顯著下調(P<0.01)。見圖2。

圖2 吳茱萸堿干預14 d后各組小鼠腫瘤組織HIF-1α、VEGF mRNA表達水平

2.3 吳茱萸堿對Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織中HIF-1α及VEGF蛋白表達及MVD的影響 吳茱萸堿干預14 d后,與模型對照組比較,陽性對照組及吳茱萸堿低、高劑量組腫瘤組織中HIF-1α及VEGF陽性表達明顯降低(P<0.01)。見圖3,表3。吳茱萸堿干預14 d后,陽性對照組及吳茱萸堿低、高劑量組腫瘤組織中MVD顯著減少(P<0.01)。見圖4,表4。

圖3 吳茱萸堿干預14 d后各組小鼠腫瘤組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(×200)

圖4 吳茱萸堿干預14 d后各組小鼠腫瘤組織CD31蛋白表達(免疫組織化學染色,×200)

表3 各組小鼠腫瘤組織HIF-1α及VEGF免疫組織化學平均光密度值

表4 各組小鼠腫瘤組織MVD水平

3 討論

本研究所運用的Lewis小鼠肺癌細胞系,常用于在體肺癌荷瘤模型實驗[11]。相比其他人源肺癌細胞株,Lewis細胞更易成瘤,所需注射細胞數量少,且由于其來源于C57BL/6小鼠,不需要運用裸鼠進行實驗,可在SPF級環(huán)境下進行,大幅度提高了實驗的可操作性,目前在抗肺癌藥物的在體實驗中應用廣泛[12]。在注射7 d后,小鼠腋窩下可觸及明顯的腫塊,提示造模成功[13]。本研究結果表明,吳茱萸堿干預14 d過程中,與生理鹽水干預小鼠比較,腫瘤生長明顯減緩,且干預后腫瘤重量顯著降低,低、高劑量組抑瘤率分別達到了20.49%、38.54%,這些結果表明吳茱萸堿具有在體抗肺癌生長的作用。此外,本研究選取順鉑作為陽性對照[14],順鉑干預小鼠抑瘤率高于吳茱萸堿高劑量組。然而順鉑組小鼠出現脾、胸腺指數顯著降低,表明順鉑干預對小鼠免疫功能構成一定的影響。而吳茱萸堿干預組小鼠脾、胸腺指數未出現明顯降低,提示吳茱萸堿對小鼠免疫功能影響較小,相比于順鉑更加安全。然而,由于本研究只進行了臟器指數的統(tǒng)計,吳茱萸堿能否在臨床上作為一種安全有效的治療肺癌的藥物,仍需要進一步實驗驗證。

本研究還發(fā)現吳茱萸堿干預后腫瘤組織血管生成數量顯著降低,此外,吳茱萸堿還可下調腫瘤組織中VEGF及HIF-1α表達。腫瘤的生長浸潤需要血管輸送能量物質,抑制腫瘤血管的生長為開發(fā)抗腫瘤藥物提供了新思路[15-16]。HIF-1α/VEGF信號通路的激活是血管生成過程中的重要環(huán)節(jié)[17]。正常情況下,細胞中的HIF-1α可在脯氨酰羥化酶作用下被降解。腫瘤細胞增殖迅速,代謝旺盛,使其周圍長期缺氧,缺氧可引發(fā)脯氨酰羥化酶活性減退,使HIF-1α無法被降解,這時HIF-1α會進入細胞核,促進其下游相關基因VEGF的表達,VEGF可使血管通透性增高,誘導血管內皮細胞的增殖,進而對腫瘤組織中血管生成起促進作用[18-20]。

綜上所述,本研究表明吳茱萸堿具有在體的抗肺癌作用,其作用機制可能是通過下調肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF及HIF-1α表達,抑制其血管生成。

吳茱萸堿具有抗肺癌荷瘤小鼠作用,且其作用機制可能與減少腫瘤組織中HIF-1α及VEGF表達從而抑制腫瘤中血管生成相關。雖然吳茱萸堿對小鼠臟器指數無明顯影響,但其安全性(如對肝腎功能、血常規(guī)、凝血功能的影響)仍需要在體內實驗中進一步驗證。此外,吳茱萸堿的體內抗腫瘤作用及對血管生成的影響雖已驗證,但仍需要在體外實驗中進一步探索。吳茱萸堿作為一種潛在的抗腫瘤藥物,能否應用于臨床仍需要深入研究。

利益沖突聲明：作者聲明沒有利益沖突。