陳 亞,孟凡飛,劉 飛

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院:1.藥理基地;2.檢驗(yàn)科,重慶 400037)

新型納米材料應(yīng)用在生物傳感器中能夠增強(qiáng)電子傳導(dǎo)和響應(yīng)界面,可顯著放大信號,同時(shí)還可作為載體起到支撐和吸附的作用[1-3]。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)是目前最常用的腫瘤標(biāo)志物之一,作為診斷腸癌及評價(jià)其預(yù)后的重要指標(biāo),在腺癌及大細(xì)胞癌患者中升高明顯[4-5]。本研究以自制金銠空心納米球(gold-rhodium hollow nanospheres,Au/Rh-HNP)為信號放大催化劑,構(gòu)建新型納米材料免疫傳感器,研制腫瘤標(biāo)志物CEA檢測的新技術(shù),為CEA檢測提供可選方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

CEA一抗、CEA二抗、CEA標(biāo)準(zhǔn)品均購自鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司,牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、人血清白蛋白(human serum albumin,HAS)、聚乙烯吡咯烷酮(poly-vinyl pyrrolidone,PVP)購自美國Sigma公司,氧化鋁(Al2O3)粉末、1%氯金酸(HAucl4)溶液、氯化銠(RhCl3)、鐵氰化鉀、硫堇(Thi)購自美國Sigma-Aldrich公司,Au/Rh-HNP為實(shí)驗(yàn)室自制。 Z36HK低溫高速離心機(jī)購自德國Hermil有限公司,Chi650d電化學(xué)工作站購自上海辰華儀器有限公司,玻碳電極(glass carbon electrode,GCE)購自天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司,S-4800電子掃描電鏡購自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1構(gòu)建原理

傳感器構(gòu)建過程見圖1。首先在麂皮上對直徑為4 mm GCE依次用0.3 μm和50 nm Al2O3顆粒反復(fù)打磨,拋光電極表面;隨后在雙蒸水(ddH2O)、無水乙醇中超聲1 min。裸電極拋光表面沉積納米金,簡要過程如下:將拋光電極放入100 μmol/L HAuCl4溶液中,采用循環(huán)伏安(cyclic voltammetry,CV)法,設(shè)置靜息電位上下電位均為-0.2 V,電沉積30～45 s沉積納米金顆粒,從而在電極表面固化形成納米金顆粒層。在ddH2O中晃洗干凈電極,吸干水滴;在電極表面滴加20 μL CEA一抗(濃度1 μmol/L),4 ℃孵育過夜或者室溫3 h固定CEA一抗。在ddH2O中晃洗干凈電極,吸干水滴;在電極表面滴加15 μL CEA抗原,室溫孵育1 h。在ddH2O中晃洗干凈電極,吸干水滴;加入20 μL CEA二抗(濃度1 μmol/L),室溫孵育3 h。在ddH2O中晃洗干凈電極備用。

圖1 Au/Rh-HNP CEA傳感器的構(gòu)建原理

1.2.2制備Au/Rh-HNP

參照文獻(xiàn)[6]自制Au/Rh-HNP,將六水合氯化鈷(CoCl2·6H2O,10 mg)和PVP(40 000 Mw,60 mg)溶解在50 mL ddH2O(18.2 M)中,超聲10 min,并用氮?dú)?N2)吹掃10 min。然后,將1.0 mL 1% RhCl3和0.2 mL 1% HAuCl4溶液合并在單獨(dú)的燒瓶中。然后攪拌,逐滴添加新制備的硼氫化鈉(NaBH4)溶液(5 mg溶于10 mL H2O中)。添加所有NaBH4后,將所得混合物逐滴添加到CoCl2/PVP混合物中,攪拌20 min。最后,通過離心法收集沉積物,并用H2O和乙醇沖洗數(shù)次。將沉淀物重新懸浮在2 mL H2O中,并在4 ℃條件下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3制備CEA二抗Au/Rh-HNP復(fù)合物

將酶標(biāo)液、保護(hù)劑加入燒杯,攪拌;再加入100 μL硫堇,攪拌,離心,洗滌3次,加入ddH2O。再加入600 μL Au/Rh-HNP,加入CEA二抗,低溫?cái)嚢?再加入過氧化物酶,攪拌。

1.2.4制備CEA一抗復(fù)合物電極

將備好的裸電極置于1% HAuCl4溶液中,CV法沉積15 s,再置于鐵氰化鉀溶液中。CEA一抗材料溶液加到修飾后的電極上,放置8 h。置于鐵氰化鉀溶液中,CV法及電化學(xué)阻抗譜(electrochemical impedance spectroscopy,EIS)法對加抗體修飾后的GCE進(jìn)行表征,加 BSA于電極上封閉未與抗體結(jié)合的鍍金表面,置于鐵氰化鉀溶液中。

1.2.5CEA抗原的檢測

將CEA標(biāo)準(zhǔn)品分別制成20.0、5.0、1.0、0.5、0.1 mg/dL 5個(gè)濃度,加于復(fù)合電極上,于37 ℃靜置15 min,然后加入CEA抗體Au/Rh-HNP復(fù)合物,洗滌,再加入3%過氧化氫(H2O2),檢測電極電信號的變化。

1.2.6特異性實(shí)驗(yàn)

按CEA抗原檢測方法,被檢物中0.5 mg/dL HSA、0.5 mg/dL BSA作為干擾物。

1.2.7電化學(xué)檢測方法

電化學(xué)檢測在包含三電極的常規(guī)電化學(xué)池中進(jìn)行,分別采用了CV、EIS和差分脈沖伏安法(differential pulse voltammetry,DPV)進(jìn)行檢測。 CV法和EIS法在含有0.1 mol氯化鉀(KCl)的5 mmol [Fe(CN)6]3-/4-溶液中進(jìn)行;DPV在2 mL 0.1 mol磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)中進(jìn)行,加入適量H2O2作為催化底物,電壓為-0.6～0 V,掃描速率為50 mV/s。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 制備的Au/Rh-HNP表征

該金銠納米材料均呈圓球形,具有中間亮度較低、四周亮度較高的典型空心結(jié)構(gòu)。Au/Rh-HNP分布較均勻,直徑范圍為80～200 nm,見圖2。

A:bar=2.00 μm;B:bar=200 nm。

2.2 修飾電極的CV法表征

a1曲線氧化峰電流>120 μA、氧化峰還原峰電流差值<0.12 V;a2較a1電流增大;a3固化一抗后電阻增大;a4在相同電壓下較各自對應(yīng)電極曲線a3電流減小;a5捕獲二抗后電阻繼續(xù)增加,電子的傳導(dǎo)能力最小,見圖3。

a1～a5分別表示電極裸電極、表面沉積金后、固化一抗、捕獲CEA抗原后、加入Au/Rh-HNP捕獲二抗后的CV法表征。

圖3 CEA免疫傳感修飾過程CV法表征圖

2.3 修飾電極的EIS法表征

b1電阻<200 Ω;b2較b1電阻減小;b3捕獲CEA抗原對應(yīng)電極曲線b2電阻增大;b4較b3電阻增大;曲線b5表示捕獲二抗后(未加H2O2)電阻是最大的,見圖4。

b1～b5分別表示電極裸電極、表面沉積金后、固化一抗、捕獲CEA抗原后、加入Au/Rh-HNP捕獲二抗后的EIS法表征。

2.4 催化劑體積與電極電流的影響

在相同電壓下電流增大,催化前與催化后形成鮮明的對比;當(dāng)20、25、30 μL時(shí)電流沒有明顯變化,見圖5。

曲線a1表示未催化時(shí),其他曲線分別表示依次加入3% H2O2 5、10、15、20、25、30 μL條件下的電流變化。

2.5 CEA檢測結(jié)果

檢測范圍為0.1～20 mg/dL,回歸方程為:Y=0.008 7X+0.019,見圖6。

a、b、c、f、g分別檢測為20.0、5.0、1.0、0.5、0.1 mg/dL。

2.6 特異性實(shí)驗(yàn)

AFP和BSA加入后能檢測到的電流很小,而CEA抗原檢測的電流變化明顯,見圖7。

圖7 檢測特異性實(shí)驗(yàn)

3 討 論

CEA是臨床上使用最廣泛的腫瘤標(biāo)志物之一[7],與眾多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),主要功能是在腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)膠原間起黏附作用,在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移過程中扮演重要的角色[8]。健康人血清中CEA水平很低,但在不同癌癥中如乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌中可以觀察到CEA水平不同程度的升高[9-10]。另外,術(shù)前和術(shù)后定期檢查CEA水平為預(yù)測腫瘤所處階段、進(jìn)展和復(fù)發(fā)提供了有用的信息[11]。CEA的檢測方法較多,常用的檢測方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),操作步驟多,干擾因素也較多,通常由于光學(xué)背景過高而靈敏度不夠;放射免疫法(RIA)由于使用放射性元素對檢測人員和環(huán)境有危害;化學(xué)發(fā)光法準(zhǔn)確度較高,但檢測時(shí)間較長,成本較高。因此,這些方法都存在一定缺陷,開發(fā)更加靈敏、特異的CEA檢測方法對于腫瘤的早期診斷和篩查具有重要的意義。

以金和銠為材料,制備相應(yīng)納米顆粒用于檢測不同生物標(biāo)志物已有較多報(bào)道,自制的Au/Rh-HNP無色、呈圓球形,是一種中間亮度較低、四周亮度較高的典型空心結(jié)構(gòu),這種結(jié)構(gòu)可極大地?cái)U(kuò)大微球的表面積,可結(jié)合更多的信號分子,由于金與蛋白分子間有很強(qiáng)的親和力[12],因此標(biāo)記和固化蛋白分子很容易實(shí)現(xiàn)。本研究自制的Au/Rh-HNP分布均勻,直徑范圍為80～200 nm,不易聚合沉淀,因此它可能成為有潛力的蛋白分子標(biāo)記載體,從而構(gòu)建更方便的檢測方法[13-14]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,CV法表征a1曲線氧化峰電流>120 μA、氧化峰還原峰電流差值<0.12 V,表明電極達(dá)到拋光要求;a2較a1電流增大,是由于電極表面沉積金后導(dǎo)電能力增強(qiáng),電子的傳遞速度加快;a3固化一抗后電阻增大,電子的傳導(dǎo)能力較沉積金及裸電極時(shí)減小,因此在相同電壓下較各自對應(yīng)電極曲線a2電流減小,同時(shí)也小于a1的電流;a4由于捕獲抗原后電阻較前增大,電子的傳導(dǎo)能力較前裸電極、表面沉積金及固化一抗時(shí)減小,因此在相同電壓下較各自對應(yīng)電極曲線a3電流減小;a5捕獲CEA抗原后電阻繼續(xù)增加,電子的傳導(dǎo)能力最小,表明電極各步的修飾是成功的。EIS法表征b1電阻<200 Ω,表明達(dá)到拋光要求;b2較b1電阻減小,表明已沉積上金層;b3捕獲CEA抗原對應(yīng)電極曲線b2電阻增大,表明已固化了一抗;b4較b3電阻增大;曲線b5表示捕獲二抗后(未加H2O2)電阻是最大的,表明電極各步修飾是成功的。由于Au/Rh-HNP具有催化H2O2的功能,在整個(gè)催化過程中電子轉(zhuǎn)移到硫堇上,因而在相同電壓下電流增大,催化前與催化后形成鮮明的對比,說明抗原抗體已經(jīng)牢固地結(jié)合。

在CEA電極檢測中,該免疫傳感器檢測CEA的靈敏度已達(dá)到0.1 mg/dL,檢測范圍為0.1～20.0 mg/dL,表明該傳感器對不同水平的CEA溶液有良好的響應(yīng),與CEA水平間有良好的線性關(guān)系。為驗(yàn)證實(shí)傳感器的特異性,選擇5 mg/dL AFP、5 mg/dL BSA作為干擾物,從結(jié)果可以看出,AFP和BSA加入后能檢測到的電流信號很弱,而同水平CEA抗原檢測的電流信號變化明顯,表明CEA抗體的結(jié)合是特異性結(jié)合。

生物傳感器用于生物標(biāo)志物的檢測具有廣泛的應(yīng)用前景[15],傳感器與不同的生物材料或不同的生物標(biāo)志物結(jié)合,可以構(gòu)建多種不同的檢測器。本研究自制的Au/Rh-HNP具有良好的生物兼容性和吸附力,可有效放大檢測信號,同時(shí)該納米顆粒還具有H2O2的催化特性,因此具備建立不同檢測方法和檢測不同生物標(biāo)志物的潛力。本研究利用該納米顆粒與金電極結(jié)合建立了基于抗體-抗原-抗體夾心法快速、簡便、定量檢測CEA的方法,并獲得了初步的成功,為進(jìn)一步開發(fā)利用這種新型納米材料奠定了基礎(chǔ)。但本實(shí)驗(yàn)仍存在一定不足之處:沒有用臨床真實(shí)標(biāo)本對實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行驗(yàn)證,其靈敏度還有待提高,其他干擾性疾病標(biāo)志物的檢測并沒有完全囊括在本實(shí)驗(yàn)中。