楊 利,林洪升,李 屏,韋 巍,孔茵芝,謝楊益,李明芬,3,潘愛萍△

(1.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗診斷教研室,南寧 530022;2.廣西中醫(yī)藥大學研究生學院,南寧 530200;3.廣西中醫(yī)藥防治醫(yī)學分子生物學重點實驗室,南寧 530022)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見的腫瘤類型,也是目前最常見的致死性惡性腫瘤。流行病學顯示我國的HCC患者5年生存率小于15%[1]。雖然早期的HCC可以通過肝切除、移植和消融等治療方案取得了較好的治療效果,但HCC是一種高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性的腫瘤,早期診斷較難,導致了HCC治療選擇的局限性和低生存率[2]。鱉甲煎丸是由二十三味中藥組成的中成藥,源于《金匱要略·瘧病脈證并治》,具有活血化瘀、軟堅散結(jié)的功效[3]。越來越多的研究表明鱉甲煎丸具有誘導腫瘤細胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫功能、抑制腫瘤血管生成等作用?？勺兗羟惺且环N可增加蛋白質(zhì)多樣性的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制,國內(nèi)有學者認為異?？勺兗羟惺录赡茉谀[瘤發(fā)展和治療中發(fā)揮作用[4]。本研究旨在探討鱉甲煎丸是否通過增強可變剪切進而抑制HCC的發(fā)展,為HCC的診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞來源

人肝癌細胞株SMMC-7721 受贈于廣西中醫(yī)藥大學生化教研室。

1.1.2動物

60只SPF級SD雄性大鼠(許可證號:SYXK桂2013-0005),體重(200±30)g,飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學分子生物學實驗室,進食配制基礎(chǔ)飼料。

1.1.3藥品

鱉甲煎丸藥劑購自武漢中聯(lián)公司(批號:160400),其組成包括炙鱉甲、赤硝各十二分(各90 g),蜣螂六分(45 g),芍藥、牡丹、土鱉蟲各五分(各37.5 g),蜂巢四分(30 g),炒烏扇、柴胡、黃芩、鼠婦蟲、干姜、大黃、桂枝、厚樸、石韋、紫葳、炙阿膠各三分(各22.5 g),瞿麥、桃仁各二分(各15 g),葶藶、半夏、人參各一分(各7.5 g)。

1.1.4實驗試劑和儀器

DMEM細胞培養(yǎng)基(批號:8169175)和細胞培養(yǎng)所添加的胎牛血清(批號:1828728)均購自美國Thermo Scientific公司,CCK-8試劑盒(批號:6972-75-8)購自日本同仁公司?？俁NA提純試劑盒(批號:74104)購自德國Qiagen公司。測序平臺Illumina Hiseq2500購自美國Illumina公司,酶聯(lián)免疫檢測儀(Multiskan FC)購自美國Thermo Scientific公司,恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Forma)購自美國Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1血清制備

鱉甲煎丸含藥血清按參考文獻[5]的方法進行制備。1 g/kg的給藥劑量配制鱉甲煎丸生理鹽水混懸液,給予大鼠灌胃給藥(10 mL/kg),每天2次,連續(xù)3 d,第4天給藥2 h后腹主動脈取血,常溫靜置2 h后離心分離血清,56 ℃滅活30 min,經(jīng)0.45 μm和0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,置于-20 ℃下保存。將同等體積鱉甲煎丸懸液替換成生理鹽水,空白血清制備方法和流程與鱉甲煎丸含藥血清制備相同。

1.2.2細胞干預分組和培養(yǎng)

實驗組采用10%鱉甲煎丸含藥血清和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)人肝癌細胞株SMMC-7721;對照組采用10%空白血清和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)人肝癌細胞株SMMC-7721。培養(yǎng)條件均為5% CO2、37 ℃恒溫條件。

1.2.3人肝癌細胞SMMC-7721的增殖活性檢測

CCK-8法檢測鱉甲煎丸對肝癌細胞的抑制作用。在96孔板中加入約1×104個細胞懸液,每組設(shè)3個復孔,將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24 h,細胞貼壁后向培養(yǎng)板中加入100 μL制備血清(鱉甲煎丸含藥血清或空白血清)和100 μL胎牛血清。 干預24、48、72 h后,每孔加入20 μL CCK-8液,在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h,酶標儀檢測450 nm處的吸光度(A)值,重復3次。

1.2.4細胞總RNA的提取

將約1×106個細胞懸液接種至培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)過夜待其貼壁,將細胞培養(yǎng)基更換為含10%鱉甲煎丸含藥血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,RNeasy mini Kit試劑盒提取細胞總RNA。

1.2.5轉(zhuǎn)錄組測序和分析

細胞轉(zhuǎn)錄組測序和分析由深圳海一時代基因科技有限公司完成。

1.2.6差異表達基因的鑒定和分析

從兩組差異表達基因中篩選出與實驗組可變剪切事件相關(guān)的基因,采用ualcan對其進行肝癌患者生存分析,kmplot進行風險因素分析。

1.2.7GO富集分析和KEGG pathway富集分析

采用David數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析,網(wǎng)頁工具metascape進行KEGG pathway富集分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組細胞增殖活性比較

實驗組細胞的增殖活性較對照組明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(F=66.662,P=0.003),見圖1。

圖1 鱉甲煎丸含藥血清對肝癌細胞增殖活性的影響

2.2 兩組可變剪切事件分析

兩組測序后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別與人基因組進行比對,實驗組中5 736個基因發(fā)生了可變剪切,共20 447個剪切體,對照組中 5 533 個基因發(fā)生可變剪切,共18 955個剪切體。兩組均檢測到7種可變剪切事件類型,對照組以外顯子跳躍(SE)、第1個外顯子可變剪切(AFE)為主,分別為6 348(33.49%)、 6 105(32.21%),其他5種類型占比為1.57%～9.79%。實驗組主要發(fā)生的可變剪切事件類型仍為AFE、SE,分別為6 921個(33.85%)、6 775個(33.13%),其他5種類型比例為1.49%～9.27%,見圖2。

ALE:最后1個外顯子可變剪切;MXE:外顯子互斥;RI:內(nèi)含子保留;A3SS:外顯子3′端的可變剪切;A5SS:外顯子5′的可變剪切。

2.3 兩組發(fā)生可變剪切事件基因和差異表達基因分析

兩組間4 675個基因的可變剪切事件重合。實驗組中有1 061個基因不重合,對照組中有858個基因不重合,96個基因差異表達明顯,且存在多個抗腫瘤相關(guān)基因,分別為ARHGAP8、ATP5L2、BIRC7、CASP9、HES5、INPP4B、SLC6A19、TNRC18、TPT1,見圖3。

圖3 與實驗組可變剪切事件相關(guān)的差異表達基因

2.4 差異表達基因 KEGG pathway富集分析和GO富集分析

GO富集分析顯示,實驗組可變剪切事件相關(guān)的差異表達基因在分子功能(MF)方面,參與了GTPase活性的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導、細胞形態(tài)調(diào)節(jié);在細胞組成(CC)方面,組成細胞質(zhì)、外泌體、中心黏附;生物過程(BP)方面,主要參與蛋白質(zhì)結(jié)合、GTPase激活劑活性、肌動蛋白絲結(jié)合,見圖4。KEGG pathway富集分析的前20個結(jié)果顯示,實驗組可變剪切事件相關(guān)的差異表達基因主要在肌動蛋白骨架組織、細胞黏附調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)型胞吐作用等方面富集,見圖5。

圖5 實驗組可變剪切事件相關(guān)的差異表達基因KEGG pathway富集分析

2.5 差異表達基因與肝癌患者的生存分析

ualcan數(shù)據(jù)庫分析顯示,CASP9、HES5、INPP4B、SLC6A19 4個差異表達基因的表達量影響肝癌患者的生存時間(P<0.05),其余基因的高表達和低表達對肝癌患者生存時間無明顯影響(P>0.05)。

2.6 差異表達基因與病毒、酒精所致肝癌患者的生存分析

在不同肝炎病毒感染所致的肝癌中,ARHGAP8、HES5、INPP4B、TPT1起到保護因素的作用,見表1;酒精攝入所致的肝癌中,ATP5L2、HES5、INPP4B、TNRC18、TPT1起到保護因素的作用,見表2。

表1 差異表達基因與肝炎病毒感染所致肝癌患者的風險因素分析

表2 差異表達基因與酒精攝入所致肝癌患者的風險因素分析

3 討 論

目前肝癌是全世界腫瘤所致死亡的第二主要原因,而我國肝癌病例占全球病例總數(shù)的一半以上[5]。流行病學研究表明,我國80%以上肝癌因乙型/丙型肝炎病毒感染和酗酒所致[6]。HCC是最常見的原發(fā)性肝癌,80%的原發(fā)性肝癌病理診斷為HCC癌。因此研究HCC的預防和診治迫在眉睫。

有學者認為鱉甲煎丸具有誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)人免疫功能、抑制纖維化等作用[3,7]。本研究的前期實驗發(fā)現(xiàn),加入10%鱉甲煎丸含藥血清共同培養(yǎng)的SMMC-7721肝癌細胞增殖受到明顯抑制,特別是培養(yǎng)72 h后。有研究顯示,鱉甲煎丸抑制SMMC-7721肝癌細胞增殖,提高肝癌細胞的凋亡率,其抑制過程涉及許多miRNA、mRNA 和信號通路,其中代謝通路及信號通路中的核心基因PNMT和ST8SIAG是其發(fā)揮作用的重要通路[7]。但腫瘤細胞的增殖、凋亡受多因素的影響,多種細胞因子和信號轉(zhuǎn)導通路參與其中,組成了一個復雜多變的分子生物網(wǎng)絡系統(tǒng)。

可變剪切是轉(zhuǎn)錄后的一種重要調(diào)控機制,可調(diào)節(jié)mRNA亞型的翻譯并誘導蛋白質(zhì)的多樣性,從而擴展基因編碼能力[8]。人類基因組中大約95%的基因經(jīng)歷可變剪切事件[9]。越來越多的研究表明,可變剪切與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、治療、預后相關(guān),如從HCC患者中檢測到的異?？勺兗羟谢?包括p53拮抗蛋白MDM2、E3泛素連接酶、細胞表面黏附鈣黏著17蛋白等被證明是潛在的肝癌致癌基因[9-11]。也有研究表明剪切因子SRSF2在肝癌中頻繁上調(diào),與肝癌患者預后不良有關(guān)[12]。高通量測序技術(shù)的發(fā)展和肝癌樣品RNA序列數(shù)據(jù)的快速積累,為研究HCC全基因組可變剪切模式提供豐富的資源,也為肝癌提供潛在的特異性診斷與治療靶標[13]。

本研究結(jié)果顯示,兩組均檢測到7種可變剪切事件類型,其中SE和AFE發(fā)生數(shù)量最多,且每一種可變剪切事件中,實驗組發(fā)生數(shù)量均大于對照組。這些結(jié)果驗證了國內(nèi)學者認為可變剪切事件與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、治療、預后密切相關(guān)的結(jié)論[9,11]。對差異表達基因進行GO富集分析,發(fā)現(xiàn)這些基因參與了MF、CC等諸多過程,包括GTPase活性的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導、組蛋白結(jié)合等;KEGG pathway富集分析結(jié)果進一步提示,實驗組可變剪切事件相關(guān)的差異表達基因與肌動蛋白骨架組織、細胞黏附調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)型胞吐作用密切相關(guān)。說明鱉甲煎丸在肝癌細胞發(fā)生的可變剪切事件涉及多種多樣的生物學過程,其從多方面調(diào)控肝癌細胞的增殖。

在實驗組調(diào)控的可變剪切事件中,鑒定出9個差異表達基因,其中CASP9、HES5、INPP4B、SLC6A19影響肝癌患者的生存時間。CASP9是調(diào)控線粒體凋亡通路中必不可少的關(guān)鍵性分子[14]。有學者研究表明CASP9在HCC中表達明顯下調(diào),其高表達預示著HCC患者預后良好[15]。HES5在HCC中具有抗腫瘤的功能。在小鼠模型中,HES5能抑制MYC依賴的肝癌發(fā)生,而促進AKT依賴的肝癌形成和干細胞特征,而細胞培養(yǎng)的功能分析表明,HES5可降低肝癌細胞的侵襲和增殖[16]。INPP4B在人肝癌中是一種腫瘤抑制基因。高表達INPP4B可以抑制肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)換過程,此外,INPP4B可抑制肝癌細胞PI3K/AKT信號的激活[17]。SLC6A19作為谷氨酰胺轉(zhuǎn)運體,在癌癥的給藥治療中也發(fā)揮著重要作用[18]。綜合課題組的研究結(jié)果和相關(guān)文獻的報道,推測鱉甲煎丸通過可變剪切事件引起肝癌細胞CASP9、HES5、INPP4B、SLC6A19基因差異表達,進而在抑制肝癌的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在我國乙型肝炎病毒感染和酒精攝入是肝癌高發(fā)的危險因素之一。在對鱉甲煎丸調(diào)控可變剪切事件中密切相關(guān)的9個基因進行風險因素分析發(fā)現(xiàn),不同肝炎病毒所致的肝癌中,ARHGAP8、HES5、INPP4B、TPT1起保護作用;在酒精攝入所致的肝癌中,ATP5L2、HES5、INPP4B、TNRC18、TPT1起保護作用。鱉甲煎丸對于我國肝癌常見的風險因素具有潛在的調(diào)節(jié)和保護作用。

綜上所述,可變剪切事件可能涉及鱉甲煎丸治療肝癌相關(guān)的基因和主要的生物學過程。因此,進一步挖掘可變剪切事件及其相關(guān)基因在肝癌中扮演的角色,對深入探討鱉甲煎丸抑癌機制和鑒定新的肝癌靶點具有重要的意義。