張德儉 喬浩然 閔紅巍 趙立希

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎 (knee osteoarthritis，KOA) 是一種高發(fā)于老年人群的常見病。KOA 將破壞關(guān)節(jié)軟骨完整性、導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形、出現(xiàn)軟骨下骨板病變和骨質(zhì)增生，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。KOA 的發(fā)病因素有很多包括年齡、外傷、肥胖和遺傳等，其中遺傳因素占 20%[1]。全基因組關(guān)聯(lián)分析 (genome wide association study，GWAS) 提示基因多態(tài)性與 KOA的易感性有關(guān)。在對北美白種人群 KOA 的 GWAS分析中發(fā)現(xiàn)，rs4867568、rs143383、rs835487 和rs8044769 多態(tài)性與 KOA 的易感性有關(guān)[2]。除此之外，也有很多文獻(xiàn)報道了中國漢族人群基因多態(tài)性與 KOA 易感性的關(guān)系，比如 FGF18 基因 rs3884606多態(tài)性[3]和白介素-6 (interleukin-6，IL-6) 基因啟動子區(qū) -174G / C 基因多態(tài)性[4]與 KOA 相關(guān)。

對染色體 7q22 區(qū)段的研究提示 COG5 基因多態(tài)性與 KOA 有關(guān)，GWAS 研究發(fā)現(xiàn)荷蘭白種人群COG5 基因的 rs3815148 和 rs3757713 多態(tài)性與 KOA的易感性相關(guān)[5]，且 Meta 分析也顯示 COG5 基因與 KOA 的易感性有關(guān)[6]。Gao 等[7]將 GWAS 分析與通路分析相結(jié)合，找到了包括 COG5 基因在內(nèi)的 3 個 KOA 差異表達(dá)基因。之前對于 rs3815148 和rs3757713 這兩個單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism，SNP) 與 KOA 的關(guān)聯(lián)性研究主要集中于白種人，對于中國人群的相關(guān)性鮮見報道。因此，本研究主要探討 COG5 基因 rs3815148 和rs3757713 多態(tài)性與中國北方漢族人群 KOA 的關(guān)聯(lián)性，分析其與 KOA 發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

資料與方法

一、納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) KOA 組納入標(biāo)準(zhǔn)：① 漢族；② 年齡 50～80 歲者；③ 符合 KOA 診斷標(biāo)準(zhǔn)者；④自愿參與本研究并簽署知情同意書者。(2) 對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：① 漢族；② 年齡 50～80 歲者；③ 無既往膝關(guān)節(jié)炎病史者；④ 自愿參與本研究并簽署知情同意書者。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 非漢族；(2) 年齡 ＞ 80 歲或 ＜ 50 歲者；(3) 不符合 KOA 的診斷標(biāo)準(zhǔn)者；(4)繼發(fā)性 KOA 者；(5) 炎癥性膝關(guān)節(jié)炎者；(6) 有嚴(yán)重基本疾病的患者。

二、一般資料

根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)，收集 2017 年1月至 2018 年 12 月在中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院和首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院就診的原發(fā)性KOA 患者 96例為 KOA 組，選擇年齡相當(dāng)?shù)?118例門診健康志愿者作為對照組，采用美國風(fēng)濕病協(xié)會的 KOA 診斷標(biāo)準(zhǔn)為診斷依據(jù)。所有研究對象均記錄其年齡和體質(zhì)量指數(shù) (body mass index，BMI)，用2 ml 乙二胺四乙酸 (ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA) 抗凝管收集全血，并分裝保存于 -80 ℃ 冰箱。本研究經(jīng)過中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn) (No.2017-075-1)。

三、DNA 提取與基因分型

將整理好的血液樣本分批在冰袋上解凍，根據(jù)QIAamp DNA Mini Kit (凱杰公司) 操作說明書進(jìn)行基因組 DNA 提取，1.5 μl 去離子水從離心柱上洗脫DNA，DanoDrop 檢測 DNA 濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組完整性，提取后的基因組 DNA 保存于 4 ℃冰箱中。取保存于 4 ℃ 冰箱中的 DNA 為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction，PCR)，上游引物序列為 5’-TCTGGAGGTTCAAGGTGGAG-3’，下游引物為 5’-AAGGTCTTCTGCTTTAGGGA-3’，反應(yīng)條件為 94 ℃ 5 min 熱啟動，94 ℃ 45 s、57 ℃45 s、72 ℃ 45 s 循環(huán) 35 次，72 ℃ 5 min 延伸，4 ℃保存。將 PCR 擴(kuò)增后的 COG5 基因片段進(jìn)行一代測序 (上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)，從測序結(jié)果中分析 SNP 的等位基因以及基因型。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用 PASW Statistics 18.0 統(tǒng)計軟件對年齡和BMI 進(jìn)行t檢驗。SHEsis 在線程序 (http://analysis.bio-x.cn) 分析 rs3815148 和 rs3757713 的哈迪 - 溫伯格平衡 (Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)、等位基因頻率、基因型頻率以及單體型；P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜ 0.01 為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般資料比較

兩組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞ 0.05)；KOA組中女性患者較多，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.0001)；兩組 BMI 差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.0001)。說明在年齡相當(dāng)?shù)那闆r下，女性更容易患病而且 BMI 指數(shù)越高罹患 KOA 的風(fēng)險越大 (表1)。

表1 兩組一般資料比較Tab.1 General clinical data were compared between the two groups

二、SNP 多態(tài)性分析

對 rs3815148 和 rs3757713 進(jìn)行 HWE 分析結(jié)果顯示，這兩個位點在 KOA 組和對照組中均符合HWE (表2)。說明這兩個 SNP 位點在群體中達(dá)到了遺傳平衡的狀態(tài)。

表2 HWE 分析Tab.2 Hardy-Weinberg equilibrium

對 rs3815148 多態(tài)性結(jié)果的分析顯示 (表3)，KOA 組和對照組中等位基因分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P= 0.033) ，基因型分布差異也有統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.023)。其中 G 等位基因為危險因子，在顯性模型下 TT 基因型起保護(hù)作用 (P= 0.003) (表3)。

表3 rs3815148 和 rs3757713 多態(tài)性分布分析Tab.3 Results of the genotype frequency analysis of rs3815148 and rs3757713

對 rs3757713 多態(tài)性分析顯示，KOA 組和對照組中等位基因分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P= 0.022)，基因型分布差異也有統(tǒng)計學(xué)意義 (P= 0.015)。其中G 等位基因為危險因子，在顯性模型下 TT 基因型起保護(hù)作用 (P= 0.003) (表3)。

對 rs3815148 和 rs3757713 單體型分析結(jié)果顯示，KOA 組和對照組的單體型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P= 0.022)，T / T 單體型數(shù)在對照組中出現(xiàn)頻率較 KOA 組高，提示 T / T 單體型可能是 KOA 的一個保護(hù)因素 (表4)。

表4 rs3815148 和 rs3757713 單體型分析Tab.4 Results of the genotype analysis of rs3815148 and rs3757713

討 論

膝關(guān)節(jié)作為下肢最重要的承重關(guān)節(jié)之一，非常容易出現(xiàn)損傷，此病主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的膝關(guān)節(jié)疼痛、晨起僵硬、活動時發(fā)出骨摩擦音等[8]。基因多態(tài)性是指在同一基因位點可存在兩種以上的基因型，其中 SNP 指由于單個核苷酸堿基的改變而導(dǎo)致的核酸序列的多態(tài)性，SNP 也是 KOA 易感的一個重要因素[9]。

全基因組關(guān)聯(lián)分析顯示荷蘭白種人的 7q22 區(qū)與膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)易感性有關(guān)，其中 rs3815148 多態(tài)性位點的 G 等位基因能增加 1.14 倍 KOA 的發(fā)病風(fēng)險[5]。但是 rs3815148 多態(tài)性與 KOA 的關(guān)聯(lián)還處于爭議中，對英國人群的 rs3815148 分析顯示該 SNP 與骨關(guān)節(jié)炎沒有顯著性關(guān)聯(lián)[10]，在另一項針對年輕人群KOA 的基因多態(tài)性分析中也顯示 rs3815148 與 KOA無相關(guān)性[11]。在 ALFA 等位基因頻率數(shù)據(jù)庫中顯示rs3815148 的 G 等位基因在東亞人群中的分布頻率為 0.076，在本研究中對照組的 G 等位基因頻率為0.093，KOA 組中為 0.161，統(tǒng)計結(jié)果顯示 rs3815148的 G 等位基因在 KOA 組和對照組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2= 4.544，df= 1，P= 0.033)，提示 rs3815148的 G 等位基因可能是 KOA 的一個風(fēng)險因子，但是TT 基因型可能是 KOA 的一個保護(hù)因素 (χ2= 7.511，df= 2，P= 0.023)。此外，研究表明 rs3757713，同樣是 KOA 的風(fēng)險因素[5]，而且芬蘭女性中 rs3757713 G 等位基因是手骨關(guān)節(jié)炎的危險因素[12]。在 ALFA等位基因頻率數(shù)據(jù)庫中顯示 rs3757713 的 G 等位基因在東亞人群中的分布頻率為 0.1，在本研究中對照組的 G 等位基因頻率為 0.085，KOA 組中的頻率為 0.156，統(tǒng)計結(jié)果顯示 rs3815148 的 G 等位基因在KOA 組和對照組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2= 5.246，df= 1，P= 0.022)，提示 rs3757713 的 G 等位基因可能是 KOA 的一個風(fēng)險因子，而 TT 基因型可能是KOA 的保護(hù)因素 (χ2= 8.427，df= 2，P= 0.015)。由于 rs3757713 與 rs3815148 處于連鎖不平衡狀態(tài)，因此本研究也分析了這兩個 SNP 單體型的分布，結(jié)果提示 TT 單體型可能是 KOA 的保護(hù)因素 (χ2=5.193，df= 3，P= 0.022)。

人類 COG5 基因全長約 363.6 kb，包括 23 個外顯子，COG5 蛋白是拴系因子 COG 復(fù)合體的一個亞基，該復(fù)合體參與蛋白質(zhì)的分選和糖基化過程，并具有維持高爾基體完整性的作用[13]。N-聚糖可以和半乳糖凝集素結(jié)合，導(dǎo)致 IL-1β 等促炎因子的分泌，從而引起滑膜的病變并進(jìn)一步引發(fā)骨關(guān)節(jié)[14]。COG5基因的變異可導(dǎo)致先天性糖基化障礙，在相關(guān)病例報道中 COG5 基因突變導(dǎo)致先天性糖基化障礙可呈現(xiàn)的癥狀包括姿勢不穩(wěn)定、行走困難、右手手指尺骨偏斜等癥狀[15]。此外，在對萊伯氏先天性黑蒙癥中的研究發(fā)現(xiàn) COG5 基因的突變不僅能引起視網(wǎng)膜退化，還會導(dǎo)致小頭畸形和骨骼發(fā)育不良[16]。在對幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎易感位點的 GWAS 相關(guān) Meta 分析中顯示 COG5 基因順式表達(dá)數(shù)量性狀位點的 SNPs 與該疾病相關(guān)[17]。在不寧腿綜合征的 GWAS 分析中顯示相關(guān)易感基因位于基因組 7q21 和 7q22 區(qū)，且顯著相關(guān)的基因包括 COG5 等 6 個基因[18]。這些研究提示 COG5 基因與骨骼、關(guān)節(jié)等發(fā)育和功能相關(guān)。

本研究還存在一定的局限性。首先，本研究的樣本量仍然較少，包括患者和健康對照組；其次，本研究中所有正常對照組均為無明顯骨關(guān)節(jié)炎癥狀，但也不能排除少數(shù)健康者處于無癥狀狀態(tài)，或者影像學(xué)檢查為發(fā)現(xiàn)輕度骨關(guān)節(jié)炎而被納入健康對照組中。

總之，目前對骨關(guān)節(jié)炎的治療是有限的，不足以預(yù)防疾病的發(fā)生和發(fā)展。骨關(guān)節(jié)炎患者的遺傳學(xué)研究可以闡明導(dǎo)致特定疾病表現(xiàn)的分子機(jī)制，包括關(guān)節(jié)損傷，疼痛和慢性疼痛，并為治療探索提供新的思考。