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        探究可變剪接對銀屑病發(fā)病機制的影響

        2023-08-03 09:18:16王慧琴吳衛(wèi)東
        當代醫(yī)藥論叢 2023年14期
        關鍵詞:銀屑病測序樣本

        張 倩,王慧琴,吳衛(wèi)東*

        (1.石河子大學,新疆 石河子 832000;2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科,新疆 烏魯木齊 830001)

        銀屑?。╬soriasis)是一種免疫介導的遺傳病[1]。了解銀屑病患者的免疫功能以及固有免疫與適應性免疫之間的相互作用有助于控制這種復雜的疾病。目前,研究者們開始致力于分析銀屑病的基因表達。微陣列或RNA-seq 數(shù)據(jù)的差異表達分析顯示,大量的編碼和非編碼基因在銀屑病皮膚和健康對照皮膚之間存在差異表達[2]。一項基于RNA-Seq 的基因表達研究從銀屑病皮損和正常皮膚的大量樣本中發(fā)現(xiàn)了許多免疫系統(tǒng)中的差異表達基因[3]?;赗NA-Seq 數(shù)據(jù)的分析可以研究銀屑病中的選擇性剪接事件的變化。本研究將從RNA-Seq 技術角度探究是否存在相關RNA 結合蛋白,旨在尋找未發(fā)現(xiàn)的與銀屑病發(fā)病機制相關的靶基因。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 研究樣本 銀屑病病變組樣本取5 例,正常對照組樣本取5 例,針對每個樣本的比對結果用StringTie軟件進行概率模型重建樣本中的轉錄本合并各個重建的樣本轉錄本進行匯總,進而生成一個可代表本項目樣本轉錄情況的轉錄本集合。

        1.1.2 試劑和儀器 DMEM 培養(yǎng)基,PBS 緩沖液(Thermo Fisher),胰酶(Thermo Fisher),1.5% 瓊脂糖凝膠,NanoPhotometer?分光光度計,Qubit?3.0 Flurometer,安捷倫 2100 RNA Nano 6000 Assay Kit。

        1.2 方法

        1.2.1 利用RNA-Seq 數(shù)據(jù)的差異選擇性剪接分析 用1 μg 總RNA 制 備RNA-seq 文 庫,去 除DNA,用VAHTS mRNA capture Beads (Vazyme, N401) 捕獲總RNA,用RNA clean beans 純化去除的RNA。利用KAPA 鏈mRNA-Seq Kit 對RNA 進行碎片化、單鏈合成、雙鏈合成、末端修復、剪接、擴增、純化等處理,制備鏈特異性RNA-seq 文庫。最后用Qubit 4.0進行濃度定量,并置于-80 ℃冰箱中保存。進行末端修復和5’接頭連接,然后用含有3’接頭序列和隨機六聚體的RT 引物進行逆轉錄。對cDNA 進行純化和擴增,對200-500 bps 的PCR 產(chǎn)物進行純化、定量處理,-80 ℃保存?zhèn)溆?。制備文庫后,應用Illunima HiSeq X Ten 系統(tǒng)進行 150 nt 雙端高通量測序。利用HISAT2 剪接splice junction,通過ABLas 對HISAT2剪接的splice junction 進行處理。在RNA-seq 文庫中,使用Illumina Novaseq 6000 的PE150 模式進行高通量測序。

        1.2.2 差異基因功能分析 利用GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫對發(fā)現(xiàn)的差異表達基因和差異可變剪接基因進行功能聚類分析?;虮倔w是描述基因和蛋白質(zhì)功能的數(shù)據(jù)庫,分為三大類: 分子功能、生物過程和細胞成分。通過GO 分類富集分析,分析了DEG 和RASG 的功能。將GO 數(shù)據(jù)庫中的每個term 投射出相應的DEG和RASG,同時計算相關term 的基因數(shù)量。利用超幾何分布進行檢驗,可以獲得差異可變剪接基因顯著富集的GO 項在全基因組GO 注釋的背景下。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG) 是一個資源數(shù)據(jù)庫,可用于從分子水平的信息(特別是通過大分子數(shù)據(jù)集產(chǎn)生的基因組測序和其他高通量實驗技術所獲信息)了解相關高級功能和生物系統(tǒng)( 如細胞、生物和生態(tài)系統(tǒng))。

        1.3 統(tǒng)計學分析

        采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料用均數(shù)± 標準差(±s)表示,采用t檢驗,計數(shù)資料用百分比(%)表示,采用χ2 檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 質(zhì)量檢測結果

        實驗結果中樣品顯示出的堿基質(zhì)量合格,reads讀數(shù)的大部分都可以比對到CDS 區(qū)域(見圖1),并且在基因各部位均勻分布;clean reads 的質(zhì)量分析顯示,Q30 的平均值為96.72%,故該實驗中的高通量測序結果可靠。

        圖1 reads 在基因組上的分布

        2.2 差異表達基因

        選取銀屑病病變組5 例和正常對照組5 例進行高通量測序。整合分析銀屑病轉錄數(shù)據(jù)集和對照數(shù)據(jù)集的差異表達基因,利用Fold Change 和pvalue 篩選出差異表達顯著的mRNA 和lncRNA。將差異標準設定為P<0.05 且差異表達倍數(shù)大于2 時,共檢測到2180 個差異表達基因。銀屑病病變組存在差異上調(diào)基因906 個,差異下調(diào)基因1274 個。火山圖顯示,兩組樣本中mRNA 和IncRNA 的表達差異超過2 倍的轉錄本( 見圖2) ;紅點表示表達水平上調(diào)的基因,藍點表示表達水平下調(diào)的基因,黑點表示表達水平無顯著變化的基因。在本次變量剪接分析中,我們采用t檢驗法比較兩個樣本中各基因相同剪接類型變量剪接水平的變化,以P值≤0.05 為標準條件進行過濾,顯示顯著差異。兩組樣本中共發(fā)現(xiàn)差異上調(diào)基因1416 個,差異下調(diào)基因1629 個。我們對每個樣本中的RASG 和DEG 基因進行整合分析,得到246 個表達水平差異顯著且剪接水平可變的基因。

        圖2 差異表達火山圖

        2.3 差異表達功能富集分析

        本研究中通過分析銀屑病患者與正常健康者的皮膚樣本,并運用RNA-Seq 數(shù)據(jù)揭示了相關可變剪接的大規(guī)模變化。根據(jù)基因本體論可分析具有差異性表達的mRNA,進而研究銀屑病的發(fā)生發(fā)展機制(包括生物學過程、細胞組件和分子功能三類)。研究結果顯示,在細胞組成中,差異可變剪接基因主要存在于細胞質(zhì)、細胞核中,表明此類細胞組件可能與銀屑病的發(fā)病機制密切相關;其中細胞質(zhì)差異表達的基因有783 個,細胞核差異表達的基因有721 個。在生物學過程中,差異可變剪接基因主要參與脂質(zhì)代謝過程、RNA 剪接的調(diào)節(jié)、脂肪酸代謝過程、mRNA 合成過程等。分子功能過程中,差異表達的mRNA 主要參與結合氧化還原酶反應、催化酶反應、裂解酶反應,可以看出參與差異性表達的基因可通過各種生物學過程影響銀屑病的發(fā)病機制。從分子水平信息角度進行差異可變剪接基因的KEGG pathway 富集性分析可知,差異表達主要富集于代謝途徑、黏附連接、脂肪酸代謝等過程中,表明銀屑病可變剪接事件的變化與銀屑病的發(fā)病機制密切相關。

        3 討論

        以往的研究表明,可變剪接在銀屑病發(fā)病機制中具有潛在的作用。例如,TRAF3IP2 的突變亞型可能導致銀屑病的形成。TRAF3IP2 基因是導致銀屑病IL-17 信號通路的重要適配器。當TRAF3IP2 的N端存在特定的氨基酸替換時,排除外顯子2 的亞型TRAF3IP2 失去了轉導IL-17 信號調(diào)控下游基因表達的能力。這種突變亞型的表達可能會促進IL-22 和IL-17 的過度產(chǎn)生。因此,這種選擇性剪接使攜帶突變誘發(fā)者易患銀屑病[4]。金莉等人采用了一種基于大規(guī)模計算分析的系統(tǒng)生物學方法,利用銀屑病小鼠和人類數(shù)據(jù)集以及一個帶有擾動SFs 的RNA-Seq 數(shù)據(jù)庫來生成關于可變剪接在銀屑病中潛在作用的生物學假設。這項大規(guī)模的分析表明,銀屑病中有18 個保守的ES 剪接事件以及幾個候選的SFs 可能會調(diào)節(jié)銀屑病中的基因剪接[5]。一項研究顯示,NFKBIZ 基因的遺傳變異與牛皮癬的發(fā)生風險有關,并且其還可能有助于確定對抗TNF 生物藥物的反應[6]?;谠摶蛟诳筎NF 藥物發(fā)生反應中的作用,有必要對相關全轉錄本和替代轉錄本的表達差異進行研究。可見,比較抗TNF 治療前后患者的轉錄水平也是必要的。通過對轉錄本可變剪接的分析,可為銀屑病的分子機制提供解釋,并為新治療方法的提出鋪平道路。本研究的結果表明,lncRNA 的可變剪接變化與多種細胞功能息息相關,同時在銀屑病的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要的作用。根據(jù)銀屑病角質(zhì)形成細胞轉錄組分析的結果來看,銀屑病的病理改變與炎癥反應、細胞角質(zhì)化及細胞周期等多種因素相關。在細胞生命過程中,細胞周期為必不可少的過程??偟膩碚f,銀屑病的病理改變可引起lncRNA 的差異表達,lncRNA 的不同表達作用于不同的細胞通路可引起差異表達基因的失調(diào),二者共同決定了銀屑病的發(fā)病機制。目前已有研究闡述了選擇性剪接的改變在lncRNA 中的貢獻。然而,關于特定lncRNA 亞型定位和功能的研究仍然很少。有研究指出,GAS5 lncRNA 經(jīng)歷了廣泛的選擇性剪接[7],然而目前尚不清楚眾多的GAS5 替代剪接異型中哪一種參與了相關定位模式和功能的調(diào)節(jié)。除了選擇性剪接外,進行l(wèi)ncRNA 轉錄本的差異處理可能有助于分析獨特亞細胞的定位和功能[8]。有實驗表明,選擇性剪接的差異性改變可能對mRNA 和lncRNA 的分布產(chǎn)生不同的影響,需要通過進一步的研究來充分闡明這些潛在的機制[9]?,F(xiàn)在,我們可以大膽猜測銀屑病發(fā)病過程中存在可受RNA 結合蛋白調(diào)控靶基因的作用。進一步探討這些靶基因的作用機制可為銀屑病的治療提供新的方向。

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