張 爽，王謙博，郭盛磊，王振月*

? 藥材與資源?

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示光質(zhì)對(duì)刺五加實(shí)生苗基因表達(dá)的調(diào)控作用

張 爽1，王謙博2，郭盛磊3，王振月3*

1. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550000 2. 廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510000 3. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040

目的 對(duì)刺五加實(shí)生苗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析其響應(yīng)不同光質(zhì)調(diào)控的分子機(jī)制。方法 以生長(zhǎng)60 d的刺五加實(shí)生苗為材料，設(shè)置不同光質(zhì)處理組（LED-1、LED-2）和對(duì)照組 [高壓鈉燈（high pressure sodium，HPS）]，應(yīng)用Illumina HiSeqTM對(duì)其葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)測(cè)序后的結(jié)果進(jìn)行基因功能注釋、差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）篩選和共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得126 252條Unigene。其中92 681條被注釋?zhuān)?個(gè)處理組中篩選出DEGs 7664個(gè)。基因本體（gene ontology，GO）富集結(jié)果表明，DEGs在代謝過(guò)程、刺激響應(yīng)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、催化活性等功能中得到顯著富集。京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）途徑富集分析表明，DEGs顯著富集在植物激素傳導(dǎo)、糖代謝、苯丙烷類(lèi)生物合成、類(lèi)黃酮生物合成。適度光質(zhì)脅迫可以促進(jìn)刺五加實(shí)生苗中苯丙素類(lèi)化合物生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，是促進(jìn)刺五加有效成分累積的基礎(chǔ)。結(jié)論 通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，揭示了不同光質(zhì)對(duì)刺五加實(shí)生苗基因表達(dá)的調(diào)控特征，可為深入研究刺五加藥效成分的生物合成機(jī)制及栽培中的光環(huán)境設(shè)置提供科學(xué)依據(jù)。

刺五加；光質(zhì)；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；差異表達(dá)基因；轉(zhuǎn)錄因子

刺五加(Rupr. Maxim.) Harms為五加科多年生植物，以干燥根和根莖或莖入藥，具有益氣健脾、補(bǔ)腎安神等傳統(tǒng)功效，于脾肺氣虛、體虛乏力、食欲不振、肺腎兩虛，久咳虛喘、腎虛腰膝酸痛、心脾不足、失眠多夢(mèng)等癥[1-2]。刺五加是我國(guó)傳統(tǒng)大宗藥材，藥用歷史悠久且市場(chǎng)需求量大，目前以人工栽培為主[3]。研究發(fā)現(xiàn)，適度的光脅迫不僅能促進(jìn)刺五加生長(zhǎng)，對(duì)刺五加中次生代謝產(chǎn)物的累積具有顯著影響，但過(guò)多的光干預(yù)不利于植株的生長(zhǎng)[4-5]。因此在刺五加的栽培過(guò)程中，通過(guò)合理的光質(zhì)配比控制藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量顯得尤為重要。近年來(lái)隨著高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，通過(guò)比較多個(gè)樣本間的差異表達(dá)基因，來(lái)探討植物響應(yīng)環(huán)境脅迫的分子機(jī)制已成為目前研究的熱點(diǎn)[6-8]。光脅迫對(duì)植物形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理和生化反應(yīng)的影響已有深入研究，但對(duì)次生代謝調(diào)控機(jī)制的研究還較少[9-10]。本研究以刺五加為材料，分別設(shè)置對(duì)照組和適度光質(zhì)處理組，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，分析不同光質(zhì)培養(yǎng)的刺五加幼苗轉(zhuǎn)錄組水平的變化，以期在從基因表達(dá)水平上揭示光質(zhì)對(duì)刺五加幼苗生長(zhǎng)發(fā)育影響的分子調(diào)控機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 材料

刺五加實(shí)生苗所用種子采自于黑龍江省七臺(tái)河市（45°37′ N，31°15′ E），經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為刺五加(Rupr. Maxim.) Harms。

1.2 儀器

LED可控光質(zhì)照射燈，長(zhǎng)春智倫圃道農(nóng)業(yè)科技有限公司；HPS型高壓鈉燈，湖州歐迪照明有限公司；Total RNA Extractor（Trizol），上海生工有限公司；Qubit2.0 RNA檢測(cè)試劑盒，Life公司；Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒，Life公司；4S Red Plus核酸染色劑，BBI Life Science公司；第一鏈cDNA合成試劑盒EP0733，Thermo Scientific?公司；SG Fast qPCR Master Mix（2×），BBI Life Science公司；VAHTSTM mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina?，南京諾唯贊公司；VAHTSTM DNA Clean Beads，南京諾唯贊公司；Q32866 Qubit 2.0熒光計(jì)，Invitrogen公司；WH-3 微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；Thermo Scientific Sorvall Legend Micro21R臺(tái)式高速低溫離心機(jī)，Thermo公司；Cycler T100? Thermal PCR儀，BIO-RAD公司；DYY-11電泳儀，北京市六一儀器廠；H6-1型微型電泳槽，上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠；FR-980A型生物電泳圖像分析系統(tǒng)，復(fù)日科技；SW-CJ-1D型潔凈工作臺(tái)，江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠；SMA4000型微量分光光度計(jì)，Merinton公司；StepOne型熒光定量PCR儀，ABI公司。

2 方法

2.1 樣品處理

試驗(yàn)在該溫室中進(jìn)行，4月選取生長(zhǎng)勢(shì)一致的種苗移植于將其播種于以草炭土和珍珠巖的混合物為的栽培基質(zhì)（3∶1，pH≈6.0）直徑12 cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，每盆1株刺五加幼苗。為充分利用光照且互不遮蔽，將12個(gè)盆間隔構(gòu)放置在一個(gè)托盤(pán)中，采用低水位灌溉自吸式供水；定植10 d后，將所有盆隨機(jī)排列并放入3個(gè)操控架中，每個(gè)操控架設(shè)置不同光質(zhì)的培養(yǎng)光源，進(jìn)行不同光質(zhì)處理。光質(zhì)處理分別為L(zhǎng)ED-1、LED-2和對(duì)照光源高壓鈉燈（high pressure sodium，HPS），測(cè)得HPS燈的R/G/B的光合光子通量密度（PPFD）比為43.7∶54.6∶1.7；因此，LED-1處理用適當(dāng)增加了藍(lán)光配比的光譜（R/G/B，43.8∶47∶9.2）。LED-2處理增強(qiáng)了R光比（R/G/B，74.3∶12.5∶13.2）。每個(gè)操控架的所有內(nèi)部空間被設(shè)置為16 h光周期，照明周期為5:00 am～21:00 pm。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，監(jiān)測(cè)相對(duì)濕度（RH）和溫度分別為（70±10）%和25 ℃/18 ℃（白天/夜晚）。移動(dòng)苗床上方55 cm處的PPFD為（94±5）μmol/(m2·s)。處理60 d后，分別采收對(duì)照組和光質(zhì)處理的刺五加葉，洗凈后用液氮速凍，置于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 總RNA的提取與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

取刺五加葉在液氮中研成粉末，用Total RNA Extractor（Trizol）提取試劑盒進(jìn)行總RNA提取，并用Qubit 2.0檢測(cè)RNA濃度，瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA完整性以及基因組污染情況。每處理3份生物學(xué)重復(fù)。將每處理3份樣品等量混合，委托上海生工有限公司構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，并使用Illumina HiSeqTM測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)組裝及Unigene功能注釋

對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行濾過(guò)，去除測(cè)序接頭、引物以及低質(zhì)量的序列后，獲得高質(zhì)量的clean reads。使用Trinity軟件將clean reads組裝成contig，利用De Bruijn進(jìn)一步簡(jiǎn)化后獲得Unigene。然后使用BLAST軟件將Unigene序列與Non-Redundant Protein Sequence Database（NR）、Swiss-Prot、基因本體（gene ontology，GO）、clusters of orthologous groups （）、真核生物蛋白相鄰類(lèi)的聚簇（Clusters of orthologous groups for eukaryotic complete genomes，KOG）、京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得Unigene的注釋信息。

2.4 DEGs分析

使用FPKM（fragments per kilobase oftranscript per million mapped reads）計(jì)算Unigene的表達(dá)量，利用EBseq平臺(tái)篩選葉中的DEGs基因，篩選條件為值≤0.05且差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥1.5。并對(duì)篩選出的DEGs進(jìn)行GO、KEGG富集分析。

2.5 qRT-PCR驗(yàn)證

采用qRT-PCR的方法對(duì)刺五加生長(zhǎng)和苯丙素類(lèi)成分合成途徑中的5個(gè)關(guān)鍵酶基因，在不同光質(zhì)作用下對(duì)Daucus carota、PETH、GRH1、PAL3、GH31的PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。qRT-PCR為20 μL反應(yīng)體系，包括cDNA模板2 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、ddH2O 7.2 μL。檢測(cè)、、、共4個(gè)皂苷合成相關(guān)酶基因的表達(dá)量，以在各處理組和對(duì)照組中表達(dá)比較穩(wěn)定的管家基因作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)?；虮磉_(dá)量以HPS對(duì)照組的基因的表達(dá)量為1，采用2?ΔΔCt法計(jì)算。

表1 qRT-PCR引物

3 結(jié)果與分析

3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)與基因注釋

過(guò)濾原始數(shù)據(jù)后，各樣品的30堿基百分比在95%以上，且GC含量均在50%左右。將clean reads進(jìn)行組裝共得到126 252條Unigene，Unigene的50為812，其中長(zhǎng)度在1 kb以上的Unigene有17 932條。通過(guò)選擇BLAST參數(shù)值≤1×10?5和HMMER參數(shù)值≤1×10?10，最終獲得92 681個(gè)有注釋信息的Unigene，約占Unigene總數(shù)的73.41%。Unigene與NCBI和NT數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blastn比對(duì)，取值≤1×10?10并且相似度＞90%，coverage＞80%的比對(duì)結(jié)果，計(jì)算其物種分布，進(jìn)行污染檢測(cè)，目前刺五加全基因組測(cè)序尚未完成，NT數(shù)據(jù)庫(kù)中刺五加的堿基序列有限，雖未比對(duì)到刺五加，但比對(duì)到的eads遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于總reads數(shù)，足以說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所有樣品未受到其他物種污染。但HPS和LED-1所有樣品的首位比對(duì)結(jié)果都是人參C. A. Mey.排在第1位，而LED-2處理組樣品均是西洋參L.排在第1位，且前10位中HPS與LED-1品種相近，而與LED-2差別較大，表明不同處理方式對(duì)基因的注釋信息具有一定影響。

3.2 Unigene總體差異分析

為了解光質(zhì)對(duì)刺五加生理代謝影響的分子機(jī)制，采用DESeq進(jìn)行分析研究2種光質(zhì)培育刺五加幼苗與對(duì)照組間的顯著性差異基因，將篩選的條件設(shè)定為∣FC∣＞1.5且值＜0.05。從3個(gè)處理中篩選得到7664個(gè)DEGs。與HPS對(duì)照組相比，LED-1組中篩選出3699個(gè)DEGs，其中2549個(gè)上調(diào)基因和1150個(gè)下調(diào)基因，LED-2組中篩選出2428個(gè)DEGs，1662個(gè)上調(diào)基因和766個(gè)下調(diào)基因，LED-1與LED-2相比篩選出1537個(gè)DEGs，893個(gè)上調(diào)基因和644個(gè)下調(diào)基因。將不同組樣品中基因的差異倍數(shù)變化值繪制在橫軸上，并將基因表達(dá)量值的變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性繪制在縱軸上。圖1結(jié)果宏觀顯示，LED-1和LED-2組雖然差異基因少，但表達(dá)差異倍數(shù)較大，而HPS與LED-1組的表達(dá)差異倍數(shù)小，但是差異顯著。

3.3 差異基因功能注釋

為了闡釋3種處理間差異基因的功能信息，根據(jù)GO、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋。圖2顯示了DEG的GO分類(lèi)結(jié)果，其總結(jié)為3類(lèi)：生物過(guò)程，細(xì)胞組分和分子功能。在這些類(lèi)別中，“細(xì)胞凋亡”“膜質(zhì)體”“共質(zhì)體”“營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性”“核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性”和“結(jié)合體”在各差異間均表現(xiàn)顯著。其中“共質(zhì)體”“核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性”和“電子載荷活性”呈顯著減少趨勢(shì)，“節(jié)律過(guò)程”、“抗氧化活性”和“營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性”被增加顯著富集。此外，LED-1LED-2、HPSLED-2和HPSLED-1分別有484、939和1686個(gè)DEGs被注釋于22個(gè)KOG分類(lèi)中（圖3）。在KOG中，“翻譯后修飾和分子伴侶蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)”占最大比例，其次是“細(xì)胞壁、膜、包膜生物發(fā)生”和“次生代謝物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝”，然而“細(xì)胞遷移”在LED-1LED-2和HPSLED-2之間沒(méi)有響應(yīng)基因。為了鑒定轉(zhuǎn)錄組中代表的潛在生物途徑。將KEGG用于進(jìn)一步分析。結(jié)果顯示，LED-1 vs LED-2中有733個(gè)DEGs分配到189個(gè)KEGG途徑，其中在“氧化磷酸化”“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工”和“核糖體”途徑中顯著富集。在HPSLED-1中，有1078個(gè)差異基因被注釋在220個(gè)KEGG途徑，其中在“氧化磷酸化”“氨基酸的生物合成”和“碳水化合物代謝”途徑中顯著富集。在HPSLED-1中，有1865個(gè)DEGs注釋于248個(gè)KEGG途徑，其中在“苯丙烷類(lèi)生物合成”“植物-病原體相互作用”“植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”和“核糖體”顯著富集。

a-HPS vs LED-1中DEGs b-HPS vs LED-2中DEGs c-LED-1 vs LED-2中DEGs 圖中的每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因，其中紅色表示上調(diào)基因，綠色表示下調(diào)基因，黑色表示非差異基因

3.4 DEGs功能富集分析

為了提高2種光質(zhì)對(duì)刺五加生長(zhǎng)影響研究可靠性，識(shí)別出生物現(xiàn)象最相關(guān)生物學(xué)途徑，采用超幾何分布對(duì)基因富集分析，找出2種光質(zhì)處理后與HPS對(duì)照組相比較，表達(dá)水平有差異的基因集。結(jié)果表明，與HPS對(duì)照組相比，LED-1光質(zhì)處理組苗具有值＜0.05的顯著差異性基因集共392個(gè)，其中上調(diào)基因集273，下調(diào)基因集119個(gè)，在這些基因集所標(biāo)注中可以看出，LED-1顯著促進(jìn)了刺五加細(xì)胞壁組織、細(xì)胞基質(zhì)的合成過(guò)程，為刺五加生長(zhǎng)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，而且，LED-1處理還促進(jìn)了激素接到和激素傳遞等反應(yīng)功能基因，并顯著提高了細(xì)胞對(duì)激素表達(dá)刺激的基因表達(dá)，證明其有效促進(jìn)了刺五加實(shí)生苗體內(nèi)激素含量，具體激素類(lèi)型可結(jié)合KEGG激素相關(guān)合成通路進(jìn)行分析；LED-2光質(zhì)處理組苗具有值＜0.05的顯著差異性基因集共201個(gè)，其中上調(diào)基因集152個(gè)，下調(diào)基因集59個(gè)，LED-2光質(zhì)與LED-1光質(zhì)促進(jìn)的基因集具有顯著差異，LED-2光質(zhì)似乎更有刺激刺五加實(shí)生苗光合系統(tǒng)的發(fā)育，其對(duì)葉綠體、類(lèi)囊體的基因集具有顯著影響，LED-2對(duì)于次生代謝產(chǎn)物具有非常顯著的基因集提高，但由于LED-2光質(zhì)的光能較強(qiáng)，對(duì)于刺五加實(shí)生苗具有一定的刺激作用，從顯著的基因集中可以看出，其顯著提高了應(yīng)激性防御基因集的表達(dá)。根據(jù)顯著富集的功能最高的前30個(gè)DEGs集繪制散點(diǎn)圖，見(jiàn)圖4。

3.5 光質(zhì)對(duì)刺五加實(shí)生苗生長(zhǎng)代謝相關(guān)通路影響

為深入探究2種光質(zhì)模式對(duì)刺五加苗生長(zhǎng)影響機(jī)制，分別將2處理組與HPS對(duì)照組的差異基因進(jìn)行生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)通路富集，研究發(fā)現(xiàn)LED-1處理光質(zhì)對(duì)植物激素傳導(dǎo)、糖代謝和類(lèi)固醇生物合成等9條與生長(zhǎng)相關(guān)通路有影響，其中4條具有顯著性影響；LED-2處理對(duì)植物激素傳導(dǎo)等7條與生長(zhǎng)相關(guān)通路產(chǎn)生影響，但僅對(duì)植物激素方向具有顯著性影響，通路名稱(chēng)、注釋差異基因個(gè)數(shù)及顯著性見(jiàn)表2。

a-HPS vs LED-1 DEGs b-HPS vs LED-2 DEGs c-LED-1 vs LED-2 DEGs

3.6 光質(zhì)對(duì)刺五加實(shí)生苗次生代謝產(chǎn)物相關(guān)通路影響

為了深入了解2種生產(chǎn)模式光質(zhì)對(duì)于刺五加苗次生代謝影響，分別將2處理組與HPS對(duì)照組的差異基因進(jìn)行次生代謝相關(guān)通路富集，通路名稱(chēng)、注釋差異基因個(gè)數(shù)及顯著性見(jiàn)表3。結(jié)果表明，2種光質(zhì)種植模式對(duì)于苯丙烷類(lèi)生物合成、苯丙氨酸代謝和類(lèi)黃酮生物合成均有極顯著的影響，而這3條途徑包括刺五加絕大多數(shù)的藥效成分。此外，LED-2光質(zhì)對(duì)于刺五加苗的次生代謝產(chǎn)物萜類(lèi)合成，尤其是倍半萜類(lèi)和三萜類(lèi)化合物的生物合成具有顯著影響。

A-HPS/LED-1 DEGs B-HPS/LED-2 DEGs C-LED-1/LED-2 DEGs

a-HPS/LED-1 DEGs b-HPS/LED-2 DEGs 縱坐標(biāo)代表功能注釋信息，橫坐標(biāo)表示對(duì)應(yīng)的rich factor，q值大小由點(diǎn)顏色表示，顏色越深，q值越小，每個(gè)功能下包含的DEG多少用點(diǎn)大小表示

表2 不同處理與HPS對(duì)照組生長(zhǎng)代謝顯著差異通路

3.7 qRT-PCR驗(yàn)證基因表達(dá)

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中差異表達(dá)基因的可靠性，選取了刺五加生長(zhǎng)發(fā)育和苯丙氨酸類(lèi)合成途徑相關(guān)途徑的3個(gè)關(guān)鍵酶基因進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果如表4、5所示，根據(jù)2種光質(zhì)不同處理中所選定的3條代謝相關(guān)途徑，可以看出LED-1光質(zhì)處理對(duì)于植物生理生長(zhǎng)和苯丙氨酸類(lèi)合成途徑中的GRH1和PAL3與HPS對(duì)照組相比在刺五加苗體內(nèi)極顯著表達(dá)，LED-2處理組促生長(zhǎng)和苯丙氨酸類(lèi)化合物合成的相關(guān)基因GH31和PAL3表達(dá)量顯著高于HPS對(duì)照組。這些基因qRT-PCR研究結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。

表3 不同光質(zhì)處理組與HPS對(duì)照組次生代謝相關(guān)顯著差異基因表達(dá)通路

表4 LED-1處理組與HPS對(duì)照組關(guān)鍵基因qRT-PCR結(jié)果

表5 LED-2處理組與HPS對(duì)照組關(guān)鍵基因qRT-PCR結(jié)果

4 討論

光質(zhì)對(duì)植物的生長(zhǎng)和生理代謝至關(guān)重要，它不僅作為能量來(lái)源直接影響植物的光合作用，還是一種影響植物光形態(tài)建成和體內(nèi)物質(zhì)代謝活動(dòng)主要觸發(fā)信號(hào)[11]。近年來(lái)，LED燈光和不同顏色的濾光膜常被研究者用來(lái)探究光質(zhì)對(duì)植物生長(zhǎng)和次生代謝物質(zhì)積累的影響。相對(duì)于濾光膜，LED燈光有著光譜波段更加精密的優(yōu)點(diǎn)，備受學(xué)者們關(guān)注[12]。本研究通過(guò)比較其豐度和相關(guān)基因上調(diào)顯著性和差異性，在分子機(jī)制研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，LED-1光照處理對(duì)于刺五加生長(zhǎng)和發(fā)育在分子水平表現(xiàn)出主要促進(jìn)生理機(jī)制發(fā)生和激素水平，進(jìn)而促進(jìn)的刺五加苗的快速生長(zhǎng)；而LED-2對(duì)于刺五加生長(zhǎng)則有刺激性，雖然株高增長(zhǎng)更快，但是卻是一種類(lèi)似于刺激性生長(zhǎng)；這一點(diǎn)除了在次生代謝相關(guān)途徑差別印證，與LED-1光質(zhì)處理組差異基因注釋通路明顯不同，LED-2光質(zhì)處理對(duì)于刺五加苗生長(zhǎng)過(guò)程中，有多種應(yīng)激性的促生長(zhǎng)調(diào)節(jié)方式反饋。LED-2光質(zhì)處理作為刺五加苗生長(zhǎng)過(guò)程中一種環(huán)境脅迫，使得刺五加幼苗產(chǎn)生了一系列的防衛(wèi)反應(yīng)，有相當(dāng)數(shù)量涉及到PPAR信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路”等應(yīng)激性反應(yīng)生物學(xué)過(guò)程的unigene得到了差異表達(dá)。與此同時(shí)，涉及過(guò)氧物應(yīng)激系統(tǒng)、鈣離子、茉莉酸和苯丙氨酸等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的unigene差異表達(dá)也非常顯著。因此，基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)和qRT-PCR的研究結(jié)果，認(rèn)為L(zhǎng)ED-2光質(zhì)影響刺五加苗的代謝輪廓是主要是通過(guò)這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的差異表達(dá)促使轉(zhuǎn)錄因子等基因表達(dá)水平發(fā)生變化，而PAL3作為PAL基因家族成員是參與苯丙烷代謝途徑的重要酶，是生物合成苯丙烷類(lèi)天然產(chǎn)物的第1步，而且可以參與植物色素的形成。本實(shí)驗(yàn)不同處理對(duì)于PAL3的表達(dá)量均有顯著影響，且LED-1中表達(dá)量顯著高于LED-2處理，這也印證了光質(zhì)對(duì)于植物的刺激反應(yīng)和激發(fā)植物體內(nèi)“防御基因”，進(jìn)而促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的合成。

刺五加作為世界重要的藥用植物，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)其物質(zhì)基礎(chǔ)、藥理活性及其藥效學(xué)等方面展開(kāi)了廣泛而深入的研究。目前已有學(xué)者對(duì)于刺五加有效成分合成的關(guān)鍵基因進(jìn)行克隆研究，但是目前還未見(jiàn)刺五加整個(gè)基因組信息公布，公共數(shù)據(jù)庫(kù)可獲得的刺五加基因組信息非常有限。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基于Illumina HiseqTM測(cè)序平臺(tái)，對(duì)刺五加葉轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深度測(cè)序和de-novo組裝，獲得的unigene，與NR、SWISS-PROT等公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)和注釋?zhuān)⒘舜涛寮庸δ芑驍?shù)據(jù)庫(kù)。同時(shí)，對(duì)不同光質(zhì)照射處理下的刺五加unigene的表達(dá)情況進(jìn)行了深度分析，從中篩選出主要涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物激素調(diào)控、糖代謝等生物學(xué)過(guò)程的差異表達(dá)unigene。本研究通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，初步揭示了光質(zhì)改變對(duì)刺五加基因表達(dá)的調(diào)控特征，對(duì)其中一些關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行深入研究，可為刺五加藥效成分的生物合成機(jī)制以及在大田生產(chǎn)育苗中的合理優(yōu)化光環(huán)境提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Sequencing and analysis of transcriptome to reveal regulation of gene expression inseedling under light quality

ZHANG Shuang1, WANG Qian-bo2, GUO Sheng-lei3, WANG Zhen-yue3

1. Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550000, China 2. The First Affiliated Hospital/School of Clinical Medicine of Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510000, China 3. Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

To analyze the molecular mechanism of different tissues of Ciwujia ()seedlingin response to light quality by transcriptome sequencing.The seedlings of 60 dfrom moderate light quality group and control group (LED-1, LED-2) were used as the test material. And the transcriptome sequencing analysis was carried out by using Illumina HiSeqTM. After obtaining transcriptome data, gene function annotation, differentially expressed genes (DEGs) screening and and co-expression network analysis were performed.A total of 126 252 unigenes were obtained by transcriptome sequencing. Among them, 92 681 unigenes were annotated, and 7664 DEGs were screened out from three treatment groups. The GO enrichment results showed that the DEGs of the roots and leaves were both significantly enriched in metabolic process, stimulus response, cell structure, catalytic activity and other functions. The KEGG pathway enrichment analysis showed that DEGs in leaves were mainly concentrated in phytohormone transduction, sugar metabolism, phenylpropanoid biosynthesis, and flavonoid biosynthesis. Moderate light quality stress can promote the expression of key enzyme genes of phenylpropanoid biosynthesis pathway inseedlings, which is the basis for promoting the accumulation of effective components of.The high-throughput transcriptome sequencing revealed the regulatory characteristics of light quality stress on gene expression in different tissues of, which could provide scientific basis for further research on the biosynthesis mechanism of medicinal components ofand reasonable luminous environment in cultivation.

(Rupr. et Maxim.) Harms; light quality; transcriptome sequencing; differentially expressed genes; transcription factors

R286.12

A

0253 - 2670(2023)15 - 4973 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.022

2023-02-03

“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFC0500303）

張 爽（1991—），女，漢族，博士，講師，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與栽培方向。E-mail: rocmsw@163.com

通信作者：王振月，男，教授，從事中藥資源研究方向。E-mail: wangzhen_yue@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]