曾 慧，陳文良，黃文治

（廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120）

丹參注射液（Danshen injection, DSI）是一種從中藥丹參中提取的制劑，具有活血化瘀、通脈養(yǎng)心的功效，在臨床上主要用于治療心血管疾病，如冠心病、心絞痛等[1]。在中醫(yī)臨床上，瘀證是腎病常見的中醫(yī)證型，而丹參是活血化瘀的代表藥味，因而常被臨床上用于治療伴有瘀證的各種腎臟疾病[2-3]。研究表明，丹參中的多種主要成分可調(diào)控自噬，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用，例如丹酚酸B 通過抑制細(xì)胞自噬和凋亡阻止糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)展[4]。然而，DSI 對腎細(xì)胞自噬及凋亡的影響尚有待于進(jìn)一步的研究。本文旨在研究足細(xì)胞中自噬與凋亡的關(guān)系及DSI 的干預(yù)作用，以期為DSI 在腎臟疾病中的應(yīng)用提供體外的實驗數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DSI（正大青春寶藥業(yè)有限公司）；脂多糖（Sigma）；氯喹（Sigma）；雷帕霉素（Sigma）；P62抗體（Abcam）；Beclin1 抗體（CST）；β-actin 抗體（Abcam）；Caspase 3 抗體（CST）；Bax 抗體（CST）；Bcl-2 抗體（CST）；兔二抗（Abcam）；鼠二抗（Abcam）；BCA 測試盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、Loading Buffer（康為世紀(jì)生物科技股份有限公司）；ECL 超敏發(fā)光液、0.45 μm PVDF 膜（Millipore）；MPC-5 細(xì)胞（上海酶研生物科技有限公司）；培養(yǎng)基（Gibco）；雙抗（Gibco）；胎牛血清（Biological Industries）；全波長酶標(biāo)儀（Thermo）；光學(xué)倒置顯微鏡（Olympus）；全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（Tanon）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)

足細(xì)胞系MPC-5 購自上海酶研生物科技有限公司。使用RPMI-1640 培養(yǎng)基（10%胎牛血清，1%雙抗，50 U/mL INF-γ）培養(yǎng)足細(xì)胞，置于5% CO2的33 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)增殖。分化培養(yǎng)時，用RPMI-1640 培養(yǎng)基（10% 胎牛血清，1% 雙抗，1×Insulin-Transferrin-Selenium）培養(yǎng)，置于5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。脂多糖粉末用生理鹽水配置為10 mg/mL 的母液，DSI 原液用生理鹽水配置成不同稀釋比的濃度。根據(jù)前期實驗探索[5]，脂多糖造模濃度為4 μg/mL，DSI 稀釋比為1/640，氯喹最終干預(yù)濃度為20 μM，雷帕霉素的最終干預(yù)濃度為20 nM。

1.3 細(xì)胞總蛋白提取實驗

細(xì)胞實驗干預(yù)結(jié)束后，用PBS 預(yù)冷溶液潤洗培養(yǎng)板3 次，加入預(yù)冷裂解液（RIPA ：100× 蛋白酶抑制劑=99:1），80 μL/ 孔，將細(xì)胞刮下后收集至1.5 mL EP 管中，冰上裂解30 min，然后在4 ℃下以12 000 rpm 的轉(zhuǎn)速離心20 min，收集上清，用BCA 試劑盒檢測總蛋白濃度，用生理鹽水及Loading Buffer 將所有樣品配置為1 μg/mL 的終濃度。

1.4 Westernblotting 檢測

配置10% 的SDS-PAGE 分離凝膠系統(tǒng)，每孔上10 μL 制備好的蛋白樣品，垂直電泳槽1×電泳液中150 V 恒流電泳70 min。將凝膠上的蛋白通過200 mA恒流電泳60 min，使之轉(zhuǎn)印到0.45 μm 的PVDF 膜上。用5%的脫脂奶粉封閉1 h 后，4 ℃搖床慢速搖動孵育一抗過夜。次日用TBST 清洗2 次，每次10 min，孵育二抗1 h。再次用TBST 清洗2 次，每次10 min，用超敏發(fā)光液ECL 浸潤30 s 后在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影采集。得到的圖像通過ImageJ 1.53K 軟件統(tǒng)計灰度值，并與內(nèi)參進(jìn)行半定量比較。各抗體稀釋比如下：P62 抗體（1:1000）；Beclin1 抗體（1:1000）；β-actin抗體（1:1000）；Caspase 3 抗體（1:1000）；Bax 抗體（1:1000）；Bcl-2 抗體（1:1000）；兔二抗（1:5000）；鼠二抗（1:5000）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）顯示，在滿足正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗條件時（本文數(shù)據(jù)均滿足該條件），采用非配對的t檢驗進(jìn)行兩組間的比較。當(dāng)P＜0.05時，認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氯喹及雷帕霉素聯(lián)合DSI 干預(yù)對足細(xì)胞自噬的影響

為進(jìn)一步探究DSI 對脂多糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡及自噬的影響，我們給予氯喹及雷帕霉素干預(yù)，結(jié)果顯示，氯喹能夠促進(jìn)P62 蛋白的表達(dá)，雷帕霉素則能下調(diào)P62 蛋白的表達(dá)水平及上調(diào)Beclin1 蛋白的表達(dá)水平，表明氯喹抑制了足細(xì)胞的自噬，而雷帕霉素則誘導(dǎo)了足細(xì)胞的自噬。與氯喹組相比，給予氯喹和DSI干預(yù)后足細(xì)胞的自噬水平明顯上調(diào)。與雷帕霉素組相比，給予雷帕霉素和DSI 干預(yù)后足細(xì)胞的自噬水平也出現(xiàn)明顯上調(diào)的趨勢（見圖1）。這一結(jié)果表明，DSI能夠逆轉(zhuǎn)氯喹造成的自噬阻滯，其激活自噬的活性與雷帕霉素有協(xié)同作用。

圖1 氯喹與雷帕霉素干預(yù)對足細(xì)胞自噬的影響及聯(lián)合DSI 的作用

2.2 DSI 通過干預(yù)自噬影響足細(xì)胞的凋亡

以氯喹及雷帕霉素干預(yù)后，評價DSI 對足細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，氯喹抑制了Caspase 3、Bcl-2 蛋白的表達(dá)，同時給予氯喹及DSI 干預(yù)后，Caspase3、Bcl-2 蛋白的表達(dá)上升，Bax 蛋白的表達(dá)下降。給予雷帕霉素誘導(dǎo)自噬后，足細(xì)胞的凋亡出現(xiàn)了明顯的上調(diào)趨勢。同時給予DSI 干預(yù)，足細(xì)胞的Caspase 3、Bax 蛋白水平顯著下降，Bcl-2 蛋白水平顯著上調(diào)。這一結(jié)果表明誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬能夠抑制脂多糖導(dǎo)致的足細(xì)胞凋亡損傷，而抑制自噬則會導(dǎo)致脂多糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡損傷加重（見圖2）。

圖2 氯喹與雷帕霉素干預(yù)對脂多糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷自噬的影響

3 討論

自噬和凋亡是細(xì)胞重要的生理活動，密切參與腎臟疾病的發(fā)展[6]。在腎臟中，足細(xì)胞是組成腎小球濾過屏障的重要細(xì)胞[7]。因而，足細(xì)胞的自噬和凋亡將直接影響腎臟濾過屏障的完整性。在脂多糖刺激的炎癥模型中，足細(xì)胞的自噬受損，此時細(xì)胞凋亡水平上升。自噬通過及時收集、降解細(xì)胞內(nèi)的受損細(xì)胞器或翻譯錯誤的大分子等，從而實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)循環(huán)[8]。當(dāng)足細(xì)胞的自噬受損后，物質(zhì)循環(huán)效率降低，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，形成惡性循環(huán)。此外，給予DSI 和自噬激動劑誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬后，細(xì)胞凋亡水平明顯下降。表明在脂多糖模型中，自噬是起保護(hù)足細(xì)胞的作用，而DSI 則可以通過誘導(dǎo)自噬抑制足細(xì)胞凋亡。本研究通過應(yīng)用自噬抑制劑和激動劑，闡明了足細(xì)胞自噬水平與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。

綜上所述，本研究從足細(xì)胞自噬誘導(dǎo)凋亡的角度闡明了DSI 在腎臟保護(hù)中的作用機(jī)制，為擴(kuò)大DSI 的臨床應(yīng)用及腎臟疾病的治療提供了新思路。