胡立業(yè) 黃碧嬌 張煒 邵海華

摘 要 目的：分析核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）與小鼠肝臟脂肪變性、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平的關(guān)系。方法：將20只小鼠隨機(jī)分為非酒精性脂肪肝組（高脂飲食飼養(yǎng)）和對(duì)照組（正常飼養(yǎng)），各10例。分別在10周、14周時(shí)測(cè)定ALT水平和NF-κB含量，觀察兩組肝組織病理形態(tài)。結(jié)果：非酒精性脂肪肝組干預(yù)10、14周時(shí)肝組織內(nèi)NF-κB含量、血清ALT水平、白介素（IL）-6、IL-1β水平均高于對(duì)照組（P<0.05）。NF-κB含量與血清ALT水平呈正相關(guān)性（P<0.05）。結(jié)論：NF-κB含量增高，可導(dǎo)致小鼠肝臟脂肪變性，且與血清ALT水平呈正相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 NF-κB 非酒精性脂肪肝 ALT 肝臟脂肪變性

中圖分類號(hào)：R589.2； R362 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2023）11-0056-03

引用本文 胡立業(yè)， 黃碧嬌， 張煒， 等. NF-κB含量與小鼠肝臟脂肪變性、血清ALT水平的關(guān)系研究[J]. 上海醫(yī)藥， 2023， 44（11）： 56-58； 66.

基金項(xiàng)目：江西省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目（2019B077）

The relationship between NF-κB content and liver steatosis and serum ALT level in mice

HU Liye， HUANG Bijiao， ZHANG Wei， SHAO Haihua

（Department of Pharmacy， the Hospital affiliated to Jinggangshan University， Jian 343000， China）

ABSTRACT Objective： To analyze the relationship between nuclear transcription factor-κB （NF-κB） and liver steatosis and serum alanine aminotransferase （ALT） level in mice. Methods： Twenty mice were randomly divided into a non-alcoholic fatty liver group （fed on a high-fat diet） and a control group （fed on a normal diet）， with 10 cases each. Serum ALT levels and NF-κB content were determined at 10 and 14 weeks， and pathological morphology of liver tissues was observed in the two groups. Results： The content of NF-κB in liver tissue， the serum ALT， interleukin-6， and IL-1β levels determined at 10 and 14 weeks of intervention in the non-alcoholic fatty liver group were all higher than those in the control group （P<0.05）. There was a positive correlation between NF-κB content and serum ALT level （P<0.05）. Conclusion： The increase of NF-κB content can lead to steatosis in the liver of mice and has a positive correlation with serum ALT level.

KEY WORDS NF-κB； non-alcoholic steatohepatitis； ALT； hepatic steatosis

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL）是危害全球人類健康的常見慢性肝臟疾病，其病理特征是非酒精性因素導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂肪變性，是諸多代謝性疾病的危險(xiǎn)因素[1]。若干預(yù)不及時(shí)，隨著疾病的不斷進(jìn)展，可逐漸發(fā)展至脂肪性肝炎、肝纖維化以及肝癌，威脅到患者的生命安全[2]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor，NF-κB）主要分布在脂肪組織中，參與了多種基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控多種細(xì)胞因子、黏附分子及趨化因子的表達(dá)，并與脂肪代謝過程、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[3]。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）主要分布在肝細(xì)胞胞漿內(nèi)，正常時(shí)僅有少量釋放入血，在病毒性肝炎急性期或肝細(xì)胞壞死時(shí)，ALT大量釋放入血，是診斷肝臟疾病的重要標(biāo)志物[4]。因此，明確NAFL的發(fā)病機(jī)制，提高臨床治療特異性顯得極其重要。本研究擬在小鼠模型中分析NF-κB含量與小鼠肝臟脂肪變性、血清ALT水平的關(guān)系，旨在為臨床病理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只雄性小鼠（C57BL/6），4周齡，SPF級(jí)，購于北京維尚利德公司，并在動(dòng)物中心清潔級(jí)屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)（井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)室提供），體質(zhì)量12～16 g。飼養(yǎng)環(huán)境：（20±2）℃、空氣濕度（50±5）%，自由進(jìn)食，晝夜均衡。

1.2 儀器和試劑

Avanti J-30I型高速低溫離心機(jī)（Beckman Coulter公司）； DR-200B參比式8通道酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司）；BS620全自動(dòng)生化分析儀（深圳邁瑞公司）；胎牛血清（AusGenex P1Y LTD，批號(hào)FBS500-S）；RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體（上海博谷生物科技有限公司）；酶聯(lián)試劑盒及配套試劑均購自武漢博士德生物工程公司。

1.3 方法

1.3.1 分組及建模

將20只雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=10），給予普通飲食正常喂養(yǎng)；NAFL組（n=10），高脂飲食喂養(yǎng)，建立非NAFL小鼠模型，高脂飲食配比：膽固醇占2%、膽酸鈉占0.5%、蔗糖占5%、丙硫氧嘧啶占0.2%、豬油占10%、基礎(chǔ)飼料占82.3%。兩組小鼠均自由飲水。在喂養(yǎng)后10、14周分別處死小鼠各5只，處死前經(jīng)股動(dòng)脈采集血液，取出肝臟組織，置于﹣80 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.3.2 肝組織病理檢查

留取的肝臟組織用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察切片病理形態(tài)。輕、中、重度脂肪肝分級(jí)分別為低倍鏡下見肝臟細(xì)胞脂肪變性范圍占肝小葉的1/3、1/3～2/3、2/3以上。

1.3.3 NF-κB測(cè)定

取肝臟組織100 mg，剪碎，添加苯甲基磺酰氟（PMSF）裂解液1 mL，冰上勻漿幾秒后，12 000 r/min離心10 min。留取上層清液，應(yīng)用雙抗體夾心法，按照試劑說明書[5]操作。在孵育過程中注意避光，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于波長450 nm測(cè)定OD值，并計(jì)算NF-κB含量。

1.3.4 血清ALT水平測(cè)定

小鼠處死前，禁食不禁水，無抗凝真空采血管采集股動(dòng)脈血液，常溫下于3 000 r/min離心10 min分離血清，置入﹣80 ℃冰箱內(nèi)保存待檢，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清ALT水平。

1.3.5 血清炎癥水平測(cè)定

將分離的血清用ELISA測(cè)定小鼠血清白介素-6（IL-6）、IL-1b表達(dá)，采用雙抗夾心法，嚴(yán)格按照說明書操作，步驟同NF-κB含量檢測(cè)方法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料用x±s表示，采取t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分比率（%）表示，采取χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)法分析兩指標(biāo)之間的相關(guān)性。P<0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠飲食飲水正常，皮膚完整，大便成形，精神活躍。對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整、肝索排列整齊，肝細(xì)胞無腫脹、無異常，無炎性細(xì)胞浸潤及肝臟脂肪變性。NAFL組，干預(yù)10周時(shí)的小鼠肝臟脂肪變性明顯，占全部視野的50%以上；干預(yù)14周時(shí)肝臟脂肪變性占全部視野的80%以上，肝臟細(xì)胞均變大、變圓，部分肝臟細(xì)胞內(nèi)見巨大脂肪滴、炎性細(xì)胞浸潤。

2.2 NF-κB含量

NAFL組干預(yù)10、14周時(shí)，肝組織內(nèi)NF-κB含量（n=5）隨著時(shí)間延長而增加，且高于對(duì)照組（P<0.05，圖1）。

2.3 血清ALT水平

NAFL組干預(yù)10、14周時(shí)檢測(cè)，結(jié)果顯示，血清ALT水平隨著時(shí)間延長而增加，且高于對(duì)照組（P<0.05，表1）。

2.4 血清炎癥水平

NAFL組干預(yù)10、14周時(shí)，血清IL-6、IL-1b水平均高于對(duì)照組（P<0.05，表2）。

2.5 相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)法分析，NF-κB含量與血清ALT水平呈正相關(guān)性（r=0.826，P<0.05）。

3 討論

NAFL發(fā)病機(jī)制尚未明確，多認(rèn)為是因各種原因?qū)е轮|(zhì)代謝紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)大量脂肪沉積，導(dǎo)致肝臟脂肪變性，造成肝臟炎癥壞死或肝臟纖維化[6]。本研究發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪肝主要病理特點(diǎn)是肝臟細(xì)胞脂肪變性，肝臟細(xì)胞內(nèi)見炎性細(xì)胞浸潤。故證實(shí)了脂肪沉積、脂質(zhì)代謝紊亂是致NAFL發(fā)生的主要原因，由于脂肪組織是細(xì)胞因子的重要來源，肝臟細(xì)胞脂肪變性會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞浸潤，促進(jìn)多種炎性細(xì)胞因子的釋放，以此加重肝臟組織脂肪變性程度[7]。

有研究表明NAFL的發(fā)生、發(fā)展與“多重打擊”學(xué)說中的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)過氧化等多種病理機(jī)制有關(guān)[8]。其中NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，它參與了機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答，能調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)。本研究結(jié)果表明模型小鼠建立后，隨著高脂飲食時(shí)間的延長，使NF-κB含量明顯增加，NF-κB含量越高，肝臟組織損傷越嚴(yán)重，且血清ALT水平越高。熊建團(tuán)等[9]研究發(fā)現(xiàn)，TLR4/NF-κB信號(hào)通路直接在非酒精性脂肪性肝病的形成過程中發(fā)揮重要作用，且NF-κB含量明顯升高，說明NF-κB信號(hào)通路參與了肝臟病變的發(fā)生、進(jìn)展過程。主要原因是NF-κB是一種被炎癥因子與反應(yīng)性氧介導(dǎo)物激活的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)NF-κB活化過度，會(huì)增加脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的沉積，促使大量炎癥因子釋放，加劇巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞活性，繼而加重肝臟炎癥反應(yīng)，另外大量炎癥介質(zhì)反作用于NF-κB，進(jìn)一步增加NF-κB活性，兩者循環(huán)加劇，最終導(dǎo)致肝臟纖維化，誘發(fā)肝臟病理狀態(tài)[10-11]。

基于NF-κB信號(hào)通路與炎癥因子之間的關(guān)系，本研究顯示，非酒精性脂肪肝組的炎癥反應(yīng)明顯升高。許俊等[12]研究發(fā)現(xiàn)，IL-18通過激活NF-κB通路調(diào)控各種炎癥因子而誘發(fā)膽汁淤積。董文娟等[13]研究指出，降脂瘦身湯通過下調(diào)NF-κB活性而能降低非酒精性脂肪肝大鼠的血脂水平，從而減輕肝臟病理損傷，說明NF-κB激活會(huì)釋放大量的炎癥因子，使體內(nèi)血清炎癥表達(dá)升高。分析原因可能是NF-κB信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)各種炎性因子影響肝臟纖維化，其異常激活會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫、炎癥等相關(guān)基因表達(dá)異常，激活炎癥反應(yīng)會(huì)加重肝臟組織損傷；同時(shí)通過組織損傷暴露的大量內(nèi)源性TLR4配體而誘導(dǎo)TLR4表達(dá)及活化，加劇脂肪代謝及胰島素抵抗，使肝臟組織損傷加重，使血清ALT水平升高。

綜合本研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB活性增強(qiáng)與小鼠肝臟脂肪變性密切相關(guān)：NF-κB活性升高，肝組織損害越明顯，證實(shí)NF-κB在肝臟組織脂肪變性中起著重要作用。其作用機(jī)制可能是NF-κB的過度激活誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，加劇脂肪代謝及胰島素抵抗，從而導(dǎo)致肝臟組織損傷加重。但肝臟脂肪變性過程復(fù)雜，且研究缺少對(duì)NF-κB信號(hào)通路的靶向基因研究，通過對(duì)NF-κB信號(hào)通路的靶向治療，能否延緩肝臟脂肪變性有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

參考文獻(xiàn)

[1] 黃華清， 向愛民， 賴大行， 等. 利拉魯肽對(duì)2型糖尿病非酒精性脂肪肝的治療作用及可能機(jī)制研究[J]. 江西醫(yī)藥， 2020， 55（4）： 382-385； 389.

[2] Manne V， Handa P， Kowdley KV. Pathophysiology of nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis[J]. Clin Liver Dis， 2018， 22（1）： 23-37.

[3] 胡波， 徐穎， 丁輝， 等. 葛根素通過抑制IκBα/NF-κB p65信號(hào)軸緩解大鼠非酒精性脂肪肝損傷[J]. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2021， 38（2）： 366-372.

[4] 桑夢(mèng)珠， 吳克儉， 李平靜， 等. 非酒精性脂肪肝患者的ALT水平及其影響因素和應(yīng)用價(jià)值分析[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志， 2021， 50（4）： 99-105.

[5] 楊清武. 一種以酶聯(lián)免疫方式檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子活性的方法： 中國， CN1477399A[P]. 2004.

[6] Anania C， Perla FM， Olivero F， et al. Mediterranean diet and nonalcoholic fatty liver disease[J]. World J Gastroenterol， 2018， 24（19）： 2083-2094.

[7] 倪斌， 易成， 張理科. 基于抗炎及抗氧化作用探討微生態(tài)制劑在非酒精性脂肪肝模型大鼠中的應(yīng)用價(jià)值[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志， 2020， 32（5）： 533-536.

[8] Wang Q， Ou Y， Hu G， et al. Naringenin attenuates nonalcoholic fatty liver disease by down-regulating the NLRP3/ NF-κB pathway in mice[J]. Br J Pharmacol， 2020， 177（8）： 1806-1821.

[9] 熊建團(tuán)， 顧鈴毓， 王青青， 等. TLR4/NF-κB信號(hào)通路對(duì)CBS+/-小鼠非酒精性脂肪性肝病的影響[J]. 中國病理生理雜志， 2021， 37（7）： 1227-1232.

[10] 姜云， 吳大強(qiáng)， 馬克龍， 等. 丹皮酚對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠炎癥因子表達(dá)的影響[J]. 中藥新藥與臨床藥理， 2019， 30（2）： 189-193.

[11] 何峰， 張雪蓮， 溫祥臣. 山楂酸對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝模型小鼠炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的影響[J]. 中國藥房， 2019， 30（7）： 901-905.

[12] 許俊， 劉少志， 王穎， 等. IL-18通過NF-κB通路調(diào)控MRP3對(duì)ANIT引起的膽汁淤積模型的影響及其機(jī)制[J].現(xiàn)代消化及介入診療， 2020， 25（5）： 613-617； 623.

[13] 董文娟， 楊立宏， 張文佳. 降脂瘦身湯對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠脂代謝及核轉(zhuǎn)錄因子-κB蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 陜西中醫(yī)， 2021， 42（8）： 1016-1019.