張 娜,劉建國(guó),王方遠(yuǎn)

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院,貴州 遵義 563099;2.貴州省普通高等學(xué)校口腔疾病研究特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨遵義市口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563006)

口腔疾病是一個(gè)全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題,困擾全球30億～50億人口,影響人體健康和生活質(zhì)量,而且對(duì)人體其他組織器官也有廣泛的影響,是導(dǎo)致糖尿病等全身性疾病的原因之一[1]?？谇话┦浅Ｒ?jiàn)的口腔疾病之一,也是致死率最高的口腔疾病。針對(duì)口腔癌的病因、發(fā)病機(jī)制及治療手段的研究,一直是研究人員的重點(diǎn)關(guān)注領(lǐng)域。隨著更多的新技術(shù)、新材料和新方法被應(yīng)用于口腔癌的基礎(chǔ)研究和臨床治療中,諸多研究方向如納米材料、光動(dòng)力學(xué)療法、光學(xué)成像、人工智能技術(shù)等都已成為口腔癌的研究熱點(diǎn)[2-4]。

近年來(lái)適配體(aptamer)作為生物分子識(shí)別新材料,已經(jīng)被應(yīng)用于藥物的研發(fā)、生物傳感器構(gòu)建、生物分子檢測(cè)、疾病的診斷和治療等各個(gè)領(lǐng)域[5],也引起口腔醫(yī)學(xué)工作者重視,其在口腔癌診斷和治療中的應(yīng)用也已成為研究熱點(diǎn),現(xiàn)對(duì)近年來(lái)適配體在口腔癌診斷和治療中的研究進(jìn)展做一綜述。

1 適配體

適配體也稱核酸適配體,是一類通過(guò)“指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化”(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技術(shù)在體外來(lái)篩選得到的寡聚核苷酸序列,包括短的單鏈DNA(ssDNA)或單鏈RNA(ssRNA),能與對(duì)應(yīng)的配體進(jìn)行特異性識(shí)別。作為分子識(shí)別元件,適配體通過(guò)折疊成不同的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu),以高的親和力與對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)配體識(shí)別并進(jìn)行特異性結(jié)合,其親和力也常常高于抗原-抗體之間的結(jié)合能力,因此適配體也被稱為“化學(xué)抗體”。與抗體相比,適配體優(yōu)勢(shì)明顯,比如尺寸更小、易合成、合成成本低、方便通過(guò)固相化學(xué)合成進(jìn)行多功能基團(tuán)修飾、可通過(guò)物理吸附或化學(xué)鍵等多種方式來(lái)固定等優(yōu)點(diǎn),同時(shí)還具有設(shè)計(jì)靈活、高溫下穩(wěn)定、體外選擇快速、低毒性、低免疫原性和更強(qiáng)的組織穿透性等優(yōu)勢(shì)。另外,其化學(xué)合成的生產(chǎn)方式使其應(yīng)用牽涉的倫理問(wèn)題更少,以上這些都表明適配體在很多方面比抗體具有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)和適用性[6]。

目前,通過(guò)研究人員的多年工作,已經(jīng)篩選得到成千上萬(wàn)種適配體,其靶標(biāo)非常廣泛,包括金屬離子、化學(xué)小分子、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞表面抗原,甚至整個(gè)細(xì)胞等,因此適配體在疾病診斷、藥物傳遞和治療等方面顯示出巨大的潛力。例如:適配體已成功運(yùn)用到抑制SARS-CoV-2病毒感染,輔助細(xì)菌腫瘤定位增強(qiáng)生物治療,檢測(cè)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、胰腺癌等癌癥中的腫瘤標(biāo)志物,另外“Macugen”等多種適配體藥物也已通過(guò)FDA批準(zhǔn)上市[7-9]。

2 適配體在口腔癌診斷和治療中的應(yīng)用

適配體在多個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展迅速,近些年已經(jīng)在口腔癌診斷和治療中得到了廣泛的應(yīng)用?？谇话┦穷^頸部最常見(jiàn)的癌癥類型之一,約占所有惡性腫瘤的4%。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)報(bào)道,2020年口腔癌約有近38萬(wàn)新發(fā)病例和近18萬(wàn)死亡病例[10],其中約90%為口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC),其他部位原發(fā)性腫瘤的轉(zhuǎn)移、黑色素瘤、肉瘤、惡性唾液腺腫瘤和牙源性腫瘤等惡性腫瘤約占10%[11]。OSCC在早期診斷并及時(shí)治療后的5年存活率是80%左右,但其早期診斷困難,一般確診時(shí)已發(fā)展為中晚期,而晚期診斷的患者5年存活率僅為20%或者更低[12],因此OSCC的早期診斷是提高存活率的最有效途徑之一[13]。常見(jiàn)的診斷途徑有影像學(xué)、病理檢查、血液或唾液生化分析等[14],而生物樣本中口腔腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)是口腔癌診斷的有效途徑和常用途徑,也是尋找有效治療策略的關(guān)鍵手段?？谇话┥飿?biāo)志物及其對(duì)應(yīng)的適配體(表1)。

表1 口腔癌中常見(jiàn)生物標(biāo)志物的適配體及其序列

2.1 外泌體 外泌體(exosome)是由細(xì)胞內(nèi)多囊泡體與細(xì)胞膜融合后釋放出來(lái)的細(xì)胞衍生囊泡,包含多種蛋白質(zhì)、mRNA和非編碼RNA等多種成分,具有細(xì)胞內(nèi)通訊和信號(hào)傳導(dǎo)等重要的生物學(xué)功能。腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體常是腫瘤的生物標(biāo)志物,包含的特定信息可以激活腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移,與健康人的唾液外泌體(67.4 ± 2.9)nm相比,OSCC患者唾液中的外泌體(98.3 ± 4.6)nm的尺寸和CD63表面密度顯著增加,其結(jié)構(gòu)和形態(tài)畸變表明外泌體可以直接進(jìn)入到OSCC患者的唾液中,因此唾液中外泌體含量與OSCC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)。OSCC患者的唾液外泌體包含著腫瘤的非侵入性診斷信息,具有靶向性高、組織滲透能力強(qiáng)等特點(diǎn),因此唾液中的外泌體可以作為OSCC非侵入性診斷的生物標(biāo)志物之一[15-16]。Wu等[17]通過(guò)外泌體表面蛋白CD63適配體(AptCD63)介導(dǎo)的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)開(kāi)發(fā)了一種基于磁性微球結(jié)合量子點(diǎn)的生物熒光探針MFBP(圖1),用于唾液中外泌體的一步法高靈敏定量檢測(cè)(檢測(cè)限低至5×102顆粒/μL)。研究顯示樣本中約88.1%的外泌體被AptCD63成功識(shí)別并結(jié)合,這說(shuō)明AptCD63上修飾的適配體與唾液中OSCC外泌體具有良好的結(jié)合效率,同時(shí)說(shuō)明OSCC外泌體在唾液中的高表達(dá)。為進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度和適用性,He等[18]以O(shè)SCC細(xì)胞(CAL27)衍生的外泌體為模型,使CD63適配體修飾的銀納米顆粒被富集到電極表面以產(chǎn)生強(qiáng)烈的信號(hào),從而構(gòu)建出一種靈敏檢測(cè)唾液中CAL27外泌體的新方法,該方法將檢測(cè)靈敏度提高了1倍多(檢測(cè)限低至2.07×102顆粒/mL),說(shuō)明該方法在臨床上具有靈敏診斷OSCC的應(yīng)用潛力。

示意圖來(lái)源于參考文獻(xiàn)[17]。

2.2 癌胚抗原 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)是最先從結(jié)腸癌和胚胎組織中提取的一種腫瘤相關(guān)性抗原,存在于內(nèi)胚層細(xì)胞分化而來(lái)的癌癥細(xì)胞的表面,被用作多種癌癥的生物標(biāo)志物[19]。Zheng等[20]采用了酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清和唾液樣本中的CEA,發(fā)現(xiàn)OSCC患者唾液CEA水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān),證實(shí)了唾液中的CEA水平可作為OSCC嚴(yán)重程度的指標(biāo),并可作為評(píng)估OSCC分期和淋巴結(jié)浸潤(rùn)程度的參考值,提示唾液中的CEA可以作為OSCC的診斷生物標(biāo)志物。Shahbazi等[21]基于CEA適配體為識(shí)別元件,以DNA為模板自組裝形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)的信號(hào)元件,該元件具有過(guò)氧化物酶活性,實(shí)現(xiàn)了對(duì)唾液中的CEA的簡(jiǎn)單、快速、可視化的高選擇性定量檢測(cè),其檢測(cè)限可以低至1 ng/mL。該方法為快速、可視化診斷OSCC提供了潛在的選擇。

2.3 乙酰肝素酶 乙酰肝素酶(heparanase,HPSE)是糖苷水解酶79家族的1種腺苷-β-葡萄糖醛酸酶,可以對(duì)硫酸乙酰肝素蛋白多糖的硫酸乙酰肝素鏈進(jìn)行裂解。HPSE在細(xì)胞外基質(zhì)中大量表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的重塑,同時(shí)釋放了與硫酸乙酰肝素結(jié)合的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子[22]。HPSE的異常表達(dá)已經(jīng)在口腔癌、乳腺癌等各類癌癥中觀察到,它在癌癥中有維持增殖信號(hào)、規(guī)避增長(zhǎng)抑制因素、抵抗細(xì)胞死亡、無(wú)限復(fù)制、誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)血管形成、激活癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移能力等作用,還可以促進(jìn)炎癥和癌癥發(fā)展,并伴隨患者預(yù)后不良[23]。Simimons等[24]報(bào)道了抗乙酰肝素酶適配體在OSCC的治療和診斷的潛力,他們篩選出3個(gè)適配體(短1.5 M,長(zhǎng)1.5 M和3.0 M),并且發(fā)現(xiàn)這些抗肝素酶適配體能夠抑制與口腔癌相關(guān)腫瘤細(xì)胞的組織侵襲,并證實(shí)了這種抑制是由于抗乙酰肝素酶適配體對(duì)該酶的抑制,而不是由于適配體的其他潛在細(xì)胞毒性作用。研究還表明,雖然較長(zhǎng)的適配體對(duì)肝素酶有更高的親和力,而短1.5 M比長(zhǎng)適配體具有更強(qiáng)的阻止腫瘤細(xì)胞入侵的能力,具有作為診斷和治療OSCC的應(yīng)用潛力。在上述的研究基礎(chǔ)上,V?yrynen等[25]進(jìn)一步比較了短1.5 M和抗乙酰肝素酶抗體的作用,發(fā)現(xiàn)二者都顯著減少人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的侵襲面積和侵襲深度,表明短1.5 M具有治療人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的潛力。

2.4 表皮生長(zhǎng)因子受體 表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是1種I型跨膜糖蛋白,屬于酪氨酸激酶受體,具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用。OSCC患者中有80%～90%過(guò)度表達(dá)EGFR,其高表達(dá)與OSCC患者的抗輻射性、預(yù)后不良以及治療后低生存率有較高的相關(guān)性,可以作為診斷OSCC的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[26]。Li等[27]篩選出EGFR的適配體E07(Kd=2.4 nM),E07與EGFR結(jié)合后阻斷受體的自磷酸化,并在三維基質(zhì)中阻止腫瘤細(xì)胞的增殖。此外E07很容易內(nèi)化到表達(dá)EGFR的細(xì)胞中,可開(kāi)發(fā)為1種很有前途的抗腫瘤藥物或造影劑。隨后,Melancon等[28]通過(guò)硫醇末端的適配體E07附著在空心金納米球(HAuNS)表面,制備成靶向EGFR的Apt-HAuNS,結(jié)合藥代動(dòng)力學(xué)、生物分布和影像學(xué)研究,在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中對(duì)比了適配體E07和EGRF抗體對(duì)EGFR的親和性和靶向選擇性。結(jié)果顯示,適配體E07是1種比EGFR抗體更好的腫瘤靶向配體,可以靶向傳遞HAuNS,用于治療過(guò)度表達(dá)EGFR的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌。

2.5 循環(huán)腫瘤細(xì)胞和上皮細(xì)胞粘附分子 從原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移到循環(huán)系統(tǒng)的癌細(xì)胞被稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell,CTC),CTC具有獨(dú)特的表型和基因型,使其能在循環(huán)系統(tǒng)中生存并參與血液循環(huán),并隨后擴(kuò)散以形成繼發(fā)性腫瘤。研究表明CTC作為液體活檢的生物標(biāo)志物在癌癥早期診斷、治療,以及癌癥的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移、預(yù)后、療效監(jiān)測(cè)等方面有著重要作用[29]。上皮細(xì)胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)廣泛表達(dá)于癌細(xì)胞源性CTC的細(xì)胞表面,因此常被用作CTC富集的靶點(diǎn)[30]。Chang等[31]報(bào)告OSCC患者中發(fā)現(xiàn)的CTC計(jì)數(shù)極高,并且CTC與OSCC的進(jìn)展、預(yù)后及免疫狀態(tài)顯著相關(guān)。鎖核酸修飾后的適配體具有更高的熱穩(wěn)定性、特異性,而且能提高細(xì)胞攝取和在血液中半衰期。Maremanda等[32]使用鎖核酸修飾的EpCAM適配體制備簡(jiǎn)單的平面微流控裝置,實(shí)現(xiàn)了對(duì)CTC高靈敏度(92%)和高特異性(100%)的快速捕獲,證實(shí)EpCAM在頭頸部腫瘤CTC中的高表達(dá),表明該裝置的快速捕獲CTC的能力在OSCC的診斷、預(yù)后和制定治療計(jì)劃方面具有巨大的應(yīng)用潛力。

2.6 腫瘤壞死因子 腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是由157個(gè)氨基酸組成的同源三聚體蛋白,可以調(diào)節(jié)免疫功能并引起部分腫瘤細(xì)胞壞死,也可以通過(guò)誘導(dǎo)炎癥和組織損傷促進(jìn)腫瘤形成,為癌癥生長(zhǎng)和擴(kuò)散創(chuàng)造有利環(huán)境,TNF-α還可以通過(guò)激活參與細(xì)胞增殖和存活的各種信號(hào)通路直接促進(jìn)口腔癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[33]。鑒于TNF-α在潛在惡性口腔疾病的進(jìn)展中的作用及其對(duì)惡性轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié),它已被提議作為口腔癌早期診斷的潛在生物標(biāo)志物,通過(guò)監(jiān)測(cè)患者的TNF-α水平有助于及早發(fā)現(xiàn)和治療這些口腔癌或潛在惡性口腔病變[34]。Zou等[35]利用嵌入分子信標(biāo)中的TNF-α適配體設(shè)計(jì)了1種高靈敏(檢測(cè)限低至1 pg/mL)檢測(cè)唾液TNF-α的電化學(xué)新方法,以實(shí)現(xiàn)對(duì)口腔癌的早期診斷。通過(guò)檢測(cè)唾液中的TNF-α驗(yàn)證了該診斷方法的有效性,這有望成為一種監(jiān)測(cè)口腔癌動(dòng)態(tài)細(xì)胞因子濃度的非侵入性方法。

2.7 黑色素瘤相關(guān)抗原A3 黑色素瘤相關(guān)抗原A3(melanoma associated antigen-A3,MAGE-A3)在多種惡性腫瘤中表達(dá),而在正常組織中不表達(dá)(除睪丸和胎盤外),具有腫瘤特異性。MAGE-A3的高表達(dá)與OSCC的浸潤(rùn)、侵襲性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌癥晚期分期等顯著相關(guān),可以作為OSCC診斷、治療、預(yù)后的重要靶標(biāo)和生物標(biāo)志物[36]。Wang等[37]篩選出針對(duì)MAGE-A3(111-125)肽抗原的適配體Ap52和Ap16,其中Ap52適配體可與口腔癌及其他癌細(xì)胞結(jié)合,而不與正常/非癌細(xì)胞結(jié)合。研究表明Ap52和Ap16都在口腔癌細(xì)胞中具有靶向性。Wang等[38]發(fā)現(xiàn)經(jīng)硫代磷酸酯修飾的Ap52與抗腫瘤藥物阿霉素(doxorubicin,Dox)的復(fù)合物可選擇性地靶向傳遞入口腔癌等癌細(xì)胞,而游離Dox則可以被所有細(xì)胞系吸收。與相應(yīng)的正常/非癌細(xì)胞相比,ThioAp52-Dox對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性得到增強(qiáng)。提示適配體Ap52可以作為治療口腔癌等癌癥的靶向治療藥物的識(shí)別基團(tuán),在藥物開(kāi)發(fā)方面有極大的前景。

2.8 C反應(yīng)蛋白和乳酸脫氫酶 C反應(yīng)蛋白(C reactive protein,CRP)是1種急性期感染和炎癥過(guò)程蛋白。慢性炎癥導(dǎo)致腫瘤血管生成和DNA損傷,這兩者都增加了CRP水平。腫瘤更大、腫瘤分期更晚的OSCC患者CRP水平越高,患者的總生存率降低[39]。提示CRP可以成為OSCC有價(jià)值的預(yù)后生物標(biāo)志物。乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)也是1種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物。由于癌癥發(fā)展的標(biāo)志之一是有氧糖酵解,反映為L(zhǎng)DH-5表達(dá)升高,而由于唾液中LDH主要來(lái)源于口腔上皮細(xì)胞并反映口腔上皮細(xì)胞的病理變化,唾液中LDH-5的水平可以用來(lái)確定OSCC的生物學(xué)行為和侵襲性,即LDH-5是OSCC的潛在生物標(biāo)志物[40]。Minagawa等[41]篩選出了與人CRP和LDH-5具有高親和力的適配體(KdCRP= 6.2 pM,KdLDH-5= 235 pM),并且在唾液樣本中展現(xiàn)了與CRP和LDH的特異性結(jié)合的能力,其高親和力和高特異性的特點(diǎn)可以為OSCC或者口腔炎癥性疾病的診斷提供更好的識(shí)別基團(tuán)。

3 展望

適配體具有體外快速選擇、低免疫原性、易于化學(xué)合成和位點(diǎn)特異性修飾、物理尺寸小、熱穩(wěn)定性高、組織滲透性好等特點(diǎn),為口腔癌的診斷、藥物遞送和治療提供了更好的可能性,盡管適配體在口腔癌診斷和治療等研究中的應(yīng)用還處于發(fā)展中,但是其已顯示出了巨大的應(yīng)用潛力。同時(shí),適配體在某些方面也顯示了一定的局限性,如:目前篩選出的口腔癌腫瘤標(biāo)志物適配體還較少,需要篩選出更多且具有更高親和力的適配體,還需要進(jìn)一步的研究和臨床驗(yàn)證來(lái)確保適配體的穩(wěn)定性、特異性和安全性,解決這些挑戰(zhàn)將有助于適配體在未來(lái)口腔癌診斷和治療等應(yīng)用中發(fā)揮更大的作用,為未來(lái)的口腔健康衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展做出更多的貢獻(xiàn)。