田 鵬,李娜娜,劉 梅,張萬敏,張小可,彭章麗,陳 玲,張 泓

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 結(jié)核病科,貴州 遵義 563099)

結(jié)核病(tuberculosis, TB)是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病,也是全球范圍內(nèi)排列靠前的傳染病殺手并在2021年導(dǎo)致了160萬人死亡[1-2]。世界衛(wèi)生組織最新報(bào)告顯示2021年全球約有640萬新發(fā)結(jié)核病例以及45萬新發(fā)耐利福平結(jié)核(rifampicin-resistant TB, RR-TB)或耐多藥結(jié)核(multi-drug resistant TB, MDR-TB)病例,而中國(guó)又是耐多藥結(jié)核病負(fù)擔(dān)最大的3個(gè)國(guó)家之一[2]。由于MDR/RR-TB的治療成功率僅為60%,耐多藥結(jié)核病依然是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危機(jī)[3]。針對(duì)這一危機(jī),世界衛(wèi)生組織于2022年12月更新了耐藥結(jié)核病治療的推薦方案,并在原來的短療程治療(9～12個(gè)月)和長(zhǎng)療程治療(18～20個(gè)月)方案基礎(chǔ)上又新推薦了用于治療MDR-TB和pre-XDR-TB(pre-extensively drug-resistant TB)的包含貝達(dá)喹啉(bedaquiline)、普托馬尼(pretomanid)、利奈唑胺(linezolid)和莫西沙星(moxifloxacin)的6個(gè)月方案(BPaLM)[3]。盡管各種治療方案在藥物組成、適應(yīng)證及患者負(fù)擔(dān)等方面有所不同,但按照藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果來選擇合理的治療方案對(duì)于提高耐藥結(jié)核病患者的治療成功率是至關(guān)重要的。微孔板藥敏檢測(cè)技術(shù)是一種新的耐多藥結(jié)核病的快速檢測(cè)方法,其原理是基于在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行測(cè)定藥物的敏感度并通過藥敏測(cè)試來了解分枝桿菌的耐藥狀況,從而指導(dǎo)臨床用藥以減少耐藥菌株的產(chǎn)生[4]。為了分析研究遵義地區(qū)近期結(jié)核分枝桿菌的耐藥情況進(jìn)而選擇合適的臨床治療方案,本研究采用了微孔板法(micropore-plate method)[4-11]針對(duì)2019年在遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收集的結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis, MTB)臨床分離菌進(jìn)行了耐藥模式分析。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)臨床診療指南的納入標(biāo)準(zhǔn)[12]來收集初治和復(fù)治患者病例。

1.1.2 標(biāo)本來源 連續(xù)采集從2019年1～12月期間在本院住院及門診肺結(jié)核患者的痰液和支氣管刷檢物標(biāo)本,采集的臨床標(biāo)本按照世衛(wèi)組織建議的程序進(jìn)行處理,并在羅氏(l?wenstein-jensen)固體培養(yǎng)基斜面上接種培養(yǎng),然后將生長(zhǎng)的菌落鑒定到物種水平[13],通過結(jié)核分枝桿菌羅氏培養(yǎng)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn),最終得到303例結(jié)核病患者的臨床分離菌。

1.1.3 藥敏試劑及使用濃度 6種一線抗結(jié)核藥物包括利福平(RIF, 1 μg/mL)、異煙肼(INH, 0.2 μg/mL)、乙胺丁醇(EMB, 2.5 μg/mL)、鏈霉素(SM, 1 μg/mL)、利福噴丁(RFT, 0.5 μg/mL)和利福布丁(RFB, 0.75 μg/mL);7種二線抗結(jié)核藥物包括左氧氟沙星(LFX, 2 μg/mL)、莫西沙星(MFX, 0.5 μg/mL)、對(duì)氨基水楊酸(PAS, 2 μg/mL)、丙硫異煙胺(PTO, 10 μg/mL)、阿米卡星(AMK, 1 μg/mL)、卷曲霉素(CAP, 2.5 μg/mL)和卡那霉素(KAN, 2.5 μg/mL);以及3種其他類抗結(jié)核藥物克拉霉素(CLR, 4 μg/mL)、力克肺疾(PI, 0.5 μg/mL)和氯法齊明(CFZ, 2 μg/mL)均購(gòu)自廣東省珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 微孔板法藥敏檢測(cè)方法基本原理[4]分枝桿菌藥敏檢測(cè)試劑盒主要由藥敏培養(yǎng)基和藥敏測(cè)試板組成,藥敏培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、促生長(zhǎng)劑和抑菌劑組成,它們能為細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖提供無機(jī)鹽、碳源、氮源和水分,豐富的營(yíng)養(yǎng)促進(jìn)分枝桿菌生長(zhǎng),通過多種抗生素抑制其他微生物的生長(zhǎng)。藥敏測(cè)試板提供不同種類及濃度的藥物。使用時(shí),將一定量的菌接種到培養(yǎng)液混勻后分裝至藥敏測(cè)試板培養(yǎng),根據(jù)各含藥孔、對(duì)照孔的生長(zhǎng)結(jié)果判斷藥物敏感性(圖1)。

微孔編號(hào)123456789101112ARef,1/10GC(+)S,1I,0.2R,1E,2.5Rft,0.5Lfx,2Am,1Cm,2.5Pto,10PI,0.5BRef,1/100GC(+)S,2I,0.4R,2E,5Rft,2Lfx,8Am,4Cm,10Pto,40PI,2CNC(-)TCH,0.25S,4I,0.8R,4E,10Mfx,0.5Pas,2Clr,4Rfb,0.75Amx/Clv,2Cfz,2DNC(-)PNB,400S,8I,1.6R,8E,20Mfx,2Pas,8Clr,16Rfb,3Amx/Clv,8Cfz,8ERef,1/10GC(+)S,1I,0.2R,1E,2.5Rft,0.5Lfx,2Am,1Cm,2.5Pto,10PI,0.5FRef,1/100GC(+)S,2I,0.4R,2E,5Rft,2Lfx,8Am,4Cm,10Pto,40PI,2GNC(-)TCH,0.25S,4I,0.8R,4E,10Mfx,0.5Pas,2Clr,4Rfb,0.75Amx/Clv,2Cfz,2HNC(-)PNB,400S,8I,1.6R,8E,20Mfx,2Pas,8Clr,16Rfb,3Amx/Clv,8Cfz,8

1.2.2 微孔板法藥敏檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)步驟[5-7]取出凍干雜菌抑制劑,將無菌稀釋液全部加入后充分搖勻混合;拿出藥敏培養(yǎng)基及藥敏測(cè)試板,使其在接種標(biāo)本前接近室內(nèi)溫度,吸取100 μL混勻的雜菌抑制劑加入到藥敏培養(yǎng)基中;分別用無菌吸嘴吸取180 μL藥敏培養(yǎng)基加入到A1或E1、B1或F1孔,分別作為1/10和1/100參照孔;用無菌吸嘴分別吸取200 μL 藥敏培養(yǎng)基加入到C1、D1或G1和H1孔作為陰性對(duì)照孔;將臨床培養(yǎng)菌株在超聲分散儀下磨菌比濁至1 mg/mL,用無菌吸嘴吸取100 μL比濁后的菌液加入到整支藥敏培養(yǎng)基中,充分搖勻混合。每孔加200 μL含有菌液的藥敏培養(yǎng)基(除上述 4 孔),再吸取20 μL含菌藥敏培養(yǎng)基至A1或E1孔作為1/10參照孔,從A1或E1孔吸20 μL至B1或F1作為 1/100參照孔,小心蓋上盒蓋,沿盒子周邊用透明膠帶封1圈后(保證密封良好),放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后首次觀察結(jié)果?？椎壮霈F(xiàn)白色菌體沉淀的為陽性,無菌體沉淀的為陰性,若為陰性,則繼續(xù)培養(yǎng)并每隔1～2天觀察結(jié)果1次,當(dāng)陽性對(duì)照孔(A2、B2或E2、F2)為陽性時(shí)進(jìn)行結(jié)果判斷,記錄每個(gè)藥物的最低抑菌濃度(MIC)值,MIC值為無白色沉淀的最低藥物濃度孔。將MIC值記錄入結(jié)果記錄紙上。當(dāng)難以判定MIC孔時(shí),可將該孔與1/10參照孔做比較,如該孔沉淀菌體小于1/10參照孔沉淀,即可判定生長(zhǎng)被抑制。如果培養(yǎng)觀察至21 d時(shí),陽性對(duì)照孔及藥敏孔無變化,則應(yīng)傳代培養(yǎng),重做實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件,初治患者與復(fù)治患者兩組數(shù)據(jù)的比較采用卡方檢驗(yàn),數(shù)據(jù)采用兩兩比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺結(jié)核患者的特征及其臨床分離菌的耐藥性 在303個(gè)肺結(jié)核患者中,男性占55.1%(167/303),女性占44.9%(136/303),男女比例為1.23∶1;初治患者占79.2%(240/303),復(fù)治患者占20.8%(63/303),初復(fù)治患者比例為3.81∶1。在初治患者中有75.4%是敏感-TB(181/240),這個(gè)比例明顯高于復(fù)治患者的比例(34.9%,22/63)。復(fù)治患者中的單耐藥-TB占比是15.9%(10/63),這與初治患者中的14.2%(34/240)占比相差不多;但是,復(fù)治患者中的多耐藥-TB比例(23.8%,15/63)和耐多藥(MDR)-TB比例(25.4%,16/63)都明顯地高于初治患者在多耐藥-TB(5.8%,14/240)和耐多藥(MDR)-TB(4.6%,11/240)中的比例(表1)。在年齡組分布中,19～39歲是發(fā)病年齡段高峰(占35.9%),其次是40～59 歲(占31.7%,表1)。

表1 303例肺結(jié)核患者的特征及其臨床分離菌的耐藥性[n(%)]

2.2 微孔板法藥敏試驗(yàn)結(jié)果 在303例結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌的藥敏試驗(yàn)中,75.4%的初治患者(181/240)和34.9%的復(fù)治患者(22/63)對(duì)16種抗結(jié)核藥物全敏感;80.4%的初治患者(193/240)和38.1%的復(fù)治患者(24/63)對(duì)4種一線抗結(jié)核藥物(RIF,INH,EMB,SM)敏感,98.8%的初治患者(237/240)和96.8%的復(fù)治患者(61/63)對(duì)喹諾酮類和二線注射類藥物敏感(表2)。在240例初治肺結(jié)核病例中,對(duì)4種一線藥物的耐藥率由高到低分別是異煙肼(13.8%)、鏈霉素(7.9%)、利福平(6.7%)和乙胺丁醇(2.9%);在63例復(fù)治肺結(jié)核病例中,對(duì)4種一線藥物的耐藥率由高到低分別是異煙肼(55.6%)、利福平(28.6%)、鏈霉素(27.0%)和乙胺丁醇(1.6%)。在303例結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌中,11.2%(34/303)為耐利福平結(jié)核,8.9%(27/303)為耐多藥結(jié)核;而多耐藥(PDR)-TB(23.8%)和耐多藥(MDR)-TB(25.4%)在復(fù)治患者中的占比遠(yuǎn)高于初治患者的占比(5.8% PDR-TB和4.6% MDR-TB,表2)。

表2 303例結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌對(duì)16種抗結(jié)核藥的敏感性和耐藥性[n(%)]

2.3 非MDR-TB臨床分離菌的耐藥模式 在276例非MDR-TB臨床分離菌中,對(duì)4種一線藥物全敏感的有78.6%(217/276),包括84.3%(193/229)的初治患者和51.1%(24/47)的復(fù)治患者。對(duì)16種抗結(jié)核藥物全敏感的有73.6%(203/276),包括79%(181/229)的初治患者和46.8%(22/47)的復(fù)治患者。對(duì)單耐一線藥物耐藥的有10.5%(29/276),其中耐藥性由高到低分別是異煙肼(6.2%)、鏈霉素(2.5%)、利福平(1.1%)和乙胺丁醇(0.7%);單耐二線藥物的耐藥性由高到低分別是克拉霉素(2.2%)、對(duì)氨基水楊酸(1.1%)、卡那霉素(0.4%)和莫西沙星(0.4%)。對(duì)2種藥物耐藥的有8.3%(23/276),對(duì)3種藥物耐藥的有2.2%(6/276),對(duì)4種藥物耐藥的有0.7%(2/276),而對(duì)5種藥物都耐藥的只有0.4%(1/276,表3)。

表3 276例非MDR-TB臨床分離菌的藥物敏感性及耐藥模式[n(%)]

2.4 MDR-TB臨床分離菌的耐藥模式 微孔板法藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示在27例MDR-TB臨床分離株中,僅對(duì)利福平和異煙肼耐藥的只占3.7%(1/27),對(duì)3種一線抗結(jié)核藥物耐藥的占14.8%(4/27),對(duì)4種抗結(jié)核藥物耐藥的占48.1%(13/27),對(duì)5種抗結(jié)核藥物耐藥的占22.2%(6/27),而對(duì)6、7、8種抗結(jié)核藥物耐藥的各占3.7%(1/27,表4)。

表4 27例MDR-TB臨床分離菌的耐藥模式[n(%)]

3 討論

抗結(jié)核藥物的耐藥性是一個(gè)重要的全球公共衛(wèi)生問題,威脅到DOTs的成功實(shí)施和全球結(jié)核病的控制。有研究結(jié)果顯示,2016—2020年貴州省登記的RR-TB患者數(shù)逐年增加,MDR-TB患者占RR-TB患者的77.5%,與2019年全球結(jié)核病報(bào)告RR-TB患者中有78%為MDR-TB結(jié)果相近[14-15],表明貴州省耐藥肺結(jié)核患者管控局面不容樂觀。而結(jié)核病患者的耐藥性監(jiān)測(cè)及藥敏結(jié)果不僅是臨床治療中制定抗結(jié)核化療方案的重要依據(jù),也是反映當(dāng)?shù)亟Y(jié)核病流行情況及防控工作的1項(xiàng)重要指標(biāo)[12]。微孔板耐多藥結(jié)核病的快速檢測(cè)方法是基于在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行的比例法測(cè)定藥物的敏感度。該方法只需要7～10 d即可以獲得分枝桿菌臨床分離菌的藥敏檢測(cè)結(jié)果,并為臨床藥物治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。該方法用微量耐藥性測(cè)試板代替?zhèn)鹘y(tǒng)試管,具有器材簡(jiǎn)單、占據(jù)范圍小、培養(yǎng)基用量少和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[4]。微孔板法在抗結(jié)核藥物的敏感性試驗(yàn)的應(yīng)用中已被證明具有操作簡(jiǎn)便且可檢測(cè)出低濃度耐藥情況的優(yōu)點(diǎn),并與BACTEC MGIT 960 液體培養(yǎng)法的結(jié)果一致性高[5-7]。

在目前的研究中,303名肺結(jié)核病患者中男性和女性患者的比例分別為55.1%和44.9%,這與我們之前對(duì)男性患者(62.8%)和女性患者(37.2%)比例的研究[16]以及與2021年世衛(wèi)組織公布的男性患者(63.8%,600萬/940萬)和女性患者(36.2%,340萬/940萬)比例[2]相比有所不同,說明遵義地區(qū)男性患者仍為結(jié)核病主要人群,但女性患者新增結(jié)核病呈上升趨勢(shì)。關(guān)于患者年齡組,109(35.9%)來自19～39歲年齡組,96(31.7%)來自40～59歲年齡組,顯然,超過2/3的結(jié)核病患者(205,67.7%)年齡在19～59歲之間,這與我們之前的研究結(jié)果一致[16]。關(guān)于患者治療情況,復(fù)治患者占20.8%(63/303),與2010年全國(guó)第5次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告的11.8%相比[17],復(fù)治患者比例明顯增多,考慮與患者依從性差和不規(guī)律用藥相關(guān),這也是耐藥結(jié)核病患者增多的重要因素。在303例肺結(jié)核患者中,初治和復(fù)治患者的耐多藥率分別為4.6%和25.4%,高于2022年世界衛(wèi)生組織全球結(jié)核報(bào)告(初治3.6%和復(fù)治18%)[2],說明該地區(qū)復(fù)治患者更容易發(fā)展成耐多藥肺結(jié)核,應(yīng)加強(qiáng)復(fù)治結(jié)核病患者的規(guī)范化管理及合理用藥。

研究結(jié)果還顯示,303例肺結(jié)核患者對(duì)二線藥物的總耐藥率為7.9%(24/303),其中,對(duì)二線注射類藥物耐藥率為2.0%(6/303),對(duì)喹諾酮類藥物耐藥率為0.7%(2/303);而在27例耐多藥結(jié)核病臨床分離菌中,對(duì)喹諾酮類藥物和對(duì)二線注射類藥物有耐藥性的耐多藥結(jié)核臨床分離菌都僅有1例(3.7%,1/27)。這些研究結(jié)果表明遵義地區(qū)結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌對(duì)二線抗結(jié)核藥物包括喹諾酮類藥物和二線注射類藥物的耐藥率極低。近年來,全球范圍內(nèi)開展了多項(xiàng)全口服短程化學(xué)治療方案的研究,WHO于2019年12月發(fā)布了關(guān)于耐藥結(jié)核病治療重大變化的快速通告,推薦既往未接受過二線抗結(jié)核藥物治療,且無氟喹諾酮類藥物耐藥、非多發(fā)結(jié)核病變或重度肺外結(jié)核的MDR/RR-TB患者,首選包含貝達(dá)喹啉的全口服短程化學(xué)治療方案[18]。因此,在遵義地區(qū),由于對(duì)二線抗結(jié)核藥物包括喹諾酮類藥物和二線注射類藥物的耐藥率極低,從而更適合推廣運(yùn)用世界衛(wèi)生組織最新推薦的用于耐多藥/耐利福平結(jié)核病的包含貝達(dá)喹啉、普托馬尼和利奈唑胺和莫西沙星(BPaLM)的6個(gè)月治療方案以及9個(gè)月全口服短程治療方案[3]。由于該方案用藥時(shí)間短及服用方便,患者更加容易堅(jiān)持治療,因此,能更有利于增加結(jié)核病患者治療依從性并提高治療成功率,從而能更有效地遏制耐多藥/耐利福平結(jié)核病的傳播。但考慮到貝達(dá)喹啉、普托馬尼和利奈唑胺等新藥的價(jià)格偏高以及結(jié)核病患者的經(jīng)濟(jì)情況,建議在今后防治工作中,貴州省醫(yī)保報(bào)銷政策能將貝達(dá)喹啉、利奈唑胺和普托馬尼等新的抗結(jié)核藥品納入報(bào)銷范圍或者提高報(bào)銷比例,從而切實(shí)降低MDR/RR-TB患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。