賈 楠,肖 飛,周 娟,伏 瑾,黃小蘭,陳 敏,黃 輝,王 毅

(1.首都兒科研究所 實(shí)驗(yàn)中心,北京 100020 ;2.首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院 感染科,北京 100020)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是導(dǎo)致乙型肝炎的重要病原體,可在分娩時(shí)通過(guò)母嬰垂直傳播感染新生兒,或通過(guò)接觸感染的血液或體液導(dǎo)致家庭內(nèi)傳播。HBV感染可引起急性或慢性肝臟損傷,嚴(yán)重者可導(dǎo)致肝功能衰竭、肝硬化、肝癌等。據(jù)世界衛(wèi)生組織(world health organization, WHO)統(tǒng)計(jì),截至2019年,全球約有2.96億人曾感染過(guò)HBV,約82萬(wàn)人死于乙型肝炎引起的并發(fā)癥[1]。我國(guó)是HBV感染的高負(fù)擔(dān)國(guó)家,國(guó)家衛(wèi)健委疾控局發(fā)布的《2021年全國(guó)法定傳染病疫情概況》顯示,病毒性肝炎(乙型肝炎約占80%)依然是中國(guó)法定報(bào)告?zhèn)魅静≈袌?bào)告病例數(shù)第一的乙類(lèi)傳染病[2]。HBV感染是嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題之一,然而,全球僅有10%的感染者接受過(guò)HBV檢測(cè)診斷,知曉自己的感染狀況[1],我國(guó)也僅有18%的乙肝患者被診斷。因此,建立快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異的HBV檢測(cè)方法對(duì)加快HBV感染診斷具有重要意義。

目前針對(duì)HBV的檢測(cè)方法主要有兩類(lèi)[3],一類(lèi)是基于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence analysis, CLIA)技術(shù)以及膠體金法等對(duì)血清中HBV相關(guān)抗原抗體的檢測(cè)[4-5],另一類(lèi)是基于聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)對(duì)HBV DNA的檢測(cè)[6]。ELISA方法是臨床上應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)HBV感染方法,但由于HBV感染還存在窗口期感染、隱匿性感染、抗原表位突變、血清學(xué)轉(zhuǎn)換等情況,該方法在這些異常情況下靈敏度較低,無(wú)法有效檢出HBV[7]?；赑CR方法檢測(cè)HBV具有靈敏、快速的特點(diǎn),能夠有效縮短血清轉(zhuǎn)換前的檢測(cè)窗口期,從而提高隱匿性HBV感染的檢出率[8],但此類(lèi)方法多需要昂貴的儀器設(shè)備、技術(shù)熟練的操作人員以及較好的實(shí)驗(yàn)條件,且結(jié)果判定方法較為復(fù)雜,因而很難在經(jīng)濟(jì)落后的地區(qū)推廣應(yīng)用。因此,建立高靈敏度、低成本、簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確的HBV診斷技術(shù)對(duì)HBV感染的預(yù)防和早期發(fā)現(xiàn)具有重要作用。多交叉置換擴(kuò)增(multiple cross-displacement amplification, MCDA)是一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù),具有較高的檢測(cè)靈敏度,目前已用于多種病原體的檢測(cè)[9-11]。金納米顆粒側(cè)向流動(dòng)生物傳感器(label-based gold nanoparticles lateral flow biosensor, LFB)具有優(yōu)良的特異性和靈敏性,可用于核酸等生物大分子的可視化檢測(cè)[12]。本研究嘗試將MCDA與LFB方法結(jié)合,建立一種準(zhǔn)確快速、簡(jiǎn)單靈敏的HBV檢測(cè)方法,同時(shí)評(píng)價(jià)HBV-MCDA-LFB在臨床樣本中的檢測(cè)效力。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 可視化檢測(cè)試劑(visual detection reagent, VDR)、LFB和Loopamp?DNA擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自天津匯德新生物技術(shù)有限公司;引物和標(biāo)記引物由北京奧科生物科技有限公司合成;核酸內(nèi)切酶Nb.BsrDI購(gòu)自北京新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室;DNA提取試劑盒(easypure blood genomic DNA Kit)購(gòu)自北京全式金有限公司;HBV RT-PCR診斷試劑盒購(gòu)自湖南圣湘生物科技有限公司;實(shí)時(shí)濁度儀LA-320C購(gòu)自日本東京艾肯化學(xué)有限公司。

1.2 菌株與臨床樣本 HBV質(zhì)粒(北京奧科生物技術(shù)有限公司合成)、2份HBV陽(yáng)性的臨床核酸樣本以及19株非HBV病原體被用于本研究(表1)。83份疑似HBV感染患者的血漿樣本來(lái)自貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院及首都兒科研究所。19株非HBV病原體和83份血漿樣本用DNA提取試劑盒提取核酸后備用。本研究通過(guò)首都兒科研究所倫理委員會(huì)倫理審批(NO:SHERLL2019012)。

表1 本研究所使用的菌株信息

1.3 金納米顆粒側(cè)向流動(dòng)生物傳感器的制備 LFB(大小:60 mm×4 mm)按照既往描述的方法[13]稍做修改進(jìn)行制備。具體操作如下:首先將樣品墊、結(jié)合墊、硝化纖維素膜(NC膜)和吸收墊依次貼于塑料粘膠墊板上,然后分別將抗熒光素抗體(anti-FAM, 0.15 mg/mL)和生物素偶聯(lián)的牛血清蛋白(biotin-BSA,2.5 mg/mL)噴涂于NC膜上作為檢測(cè)區(qū)(test line, TL)和質(zhì)控區(qū)(control line, CL),兩區(qū)之間間隔5 mm,最后將金納米顆粒偶聯(lián)的鏈霉素親和素(SA-GNP)置于結(jié)合墊上。將組裝好的LFB裝入塑料盒中,放入干燥劑,置于陰涼干燥處避光保存,有效期為18個(gè)月。

1.4 引物設(shè)計(jì) 本研究以HBV的特異性S基因(genbankaccession No.AB809557.1)為檢測(cè)靶標(biāo),使用PRIMER PREMIER 5.0軟件設(shè)計(jì)MCDA-LFB的擴(kuò)增引物。引物位置如圖1所示,引物序列及相關(guān)修飾如表2所示。

引物位置用下劃線(xiàn)和彩色文本標(biāo)識(shí);引物的有義序列和互補(bǔ)序列分別用左右箭頭標(biāo)識(shí)。

表2 HBV特異性S基因MCDA-LFB引物序列及相關(guān)修飾

1.5 HBV-MCDA檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化 HBV-MCDA的反應(yīng)體系為25 μL,包括:12.5 μL的2×反應(yīng)緩沖液,置換引物(F1、F2)各0.1 μmol/L,交叉引物(CP1、CP2)各0.4 μmol/L,擴(kuò)增引物(C1、C2、D1、D2、R1和R2)各0.2 μmol/L, 1.0 μL Bst DNA聚合酶(8 U), 1 μL Nb.BsrDI(10 uU), 1 μL(純菌)或5 μL(臨床樣本)DNA模板,補(bǔ)加蒸餾水(distilled water, DW)至25 μL。HBV質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照,HCV為陰性對(duì)照,DW為空白對(duì)照。擴(kuò)增結(jié)果利用可視染料顏色變化法和LFB法進(jìn)行檢測(cè)判別。反應(yīng)管顏色變?yōu)樗{(lán)色和LFB的TL區(qū)和CL區(qū)均出現(xiàn)紅色線(xiàn),視為陽(yáng)性結(jié)果。

1.6 HBV-MCDA最佳反應(yīng)條件驗(yàn)證 HBV-MCDA反應(yīng)溫度優(yōu)化的方法是:分別在57～64 ℃(間隔1 ℃)8個(gè)溫度條件下擴(kuò)增40 min,然后95 ℃加熱5 min終止反應(yīng)。試驗(yàn)以HBV質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照,DW為空白對(duì)照;使用實(shí)時(shí)濁度儀(LA-320C)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程,以濁度>0.1作為陽(yáng)性結(jié)果的閾值。通過(guò)比較不同反應(yīng)溫度條件下擴(kuò)增效率(出峰時(shí)間以及峰值高低)從而確定最佳反應(yīng)溫度。

HBV-MCDA反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化的方法是:利用LFB方法分別在HBV-MCDA反應(yīng)的第10～40分鐘(每隔10分鐘)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果。每個(gè)擴(kuò)增時(shí)間至少重復(fù)2次。以最早檢測(cè)出檢測(cè)限(limit of detection, LoD)水平模板的時(shí)間為最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.7 HBV-MCDA-LFB檢測(cè)的靈敏度和特異性分析 將HBV質(zhì)粒從1×105拷貝進(jìn)行10倍梯度稀釋至1×10-1拷貝,用于分析HBV-MCDA-LFB方法的檢測(cè)限和靈敏度。利用1份HBV質(zhì)粒、2份HBV陽(yáng)性核酸樣本和19株非HBV病原體(表1)的DNA模板分析HBV-MCDA-LFB方法的特異性。實(shí)驗(yàn)以DW為空白對(duì)照,并使用可視染料顏色變化法和LFB法進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2次。

1.8 HBV-MCDA-LFB檢測(cè)在臨床標(biāo)本中的檢測(cè)能力分析 83份疑似HBV感染患者的血漿樣本為貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院及首都兒科研究所收集所得。所有樣本均在參與者監(jiān)護(hù)人的知情同意下采集,且首次用于臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷。所有樣本同時(shí)利用HBV-MCDA-LFB和RT-PCR 2種方法進(jìn)行檢測(cè),并采用R軟件(4.3.0版)分析2種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性。

2 結(jié)果

2.1 HBV-MCDA引物的有效性及標(biāo)準(zhǔn)化方法的建立 基于表2所示引物進(jìn)行MCDA擴(kuò)增,利用可視染料顏色變化法、LFB法、實(shí)時(shí)濁度儀法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,結(jié)果顯示HBV質(zhì)粒模板為陽(yáng)性,HCV和DW均為陰性(圖2)。結(jié)果提示本研究所用的MCDA引物在HBV-MCDA-LFB檢測(cè)中是有效的,該引物將用于后續(xù)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

A:可視染料顏色變化方法檢測(cè)結(jié)果;B:LFB方法檢測(cè)結(jié)果;C:實(shí)時(shí)濁度儀法檢測(cè)結(jié)果;1號(hào)管/條/濁度曲線(xiàn)模板為HBV質(zhì)粒,檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性,2、3號(hào)管/條/濁度曲線(xiàn)模板為HCV和DW,檢測(cè)結(jié)果為陰性;CL:控制線(xiàn);TL:檢測(cè)線(xiàn);橫坐標(biāo)為檢測(cè)時(shí)間,縱坐標(biāo)為實(shí)時(shí)濁度。

2.2 HBV-MCDA最佳反應(yīng)條件驗(yàn)證 如圖3所示,60 ℃條件下HBV-MCDA的擴(kuò)增效率最高且速度最快。因此,60 ℃為HBV-MCDA方法的最佳反應(yīng)溫度。本研究中的后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)均在60 ℃進(jìn)行。

橫坐標(biāo)為檢測(cè)時(shí)間,縱坐標(biāo)為實(shí)時(shí)濁度;A～H:檢測(cè)溫度依次為57～64 ℃。

在HBV-MCDA的擴(kuò)增時(shí)間為30 min時(shí),LoD水平(1×101拷貝,敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果)的模板能夠被檢出(圖4C)。因此,30 min是HBV-MCDA-LFB的最佳檢測(cè)時(shí)間。

A、B、C、D: LFB 分別在HBV-MCDA反應(yīng)10、20、30、40 min后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物;1～6號(hào)條的模板為濃度為1×105拷貝～1×100拷貝的HBV質(zhì)粒,7號(hào)條的模板為蒸餾水;CL:控制線(xiàn);TL:檢測(cè)線(xiàn)。

2.3 HBV-MCDA-LFB檢測(cè)的敏感性和特異性驗(yàn)證 HBV-MCDA-LFB方法的敏感性評(píng)估結(jié)果如圖5所示,其LoD為1×101拷貝。特異性評(píng)估結(jié)果如圖6所示,HBV質(zhì)粒和2個(gè)HBV陽(yáng)性臨床樣本的MCDA的擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性,其他病原體的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。

HBV-MCDA-LFB方法的特異性分析通過(guò)可視染料顏色變化、LFB檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果;1號(hào)管/條的模板為HBV質(zhì)粒;2、3號(hào)管/條的模板為HBV陽(yáng)性的臨床核酸樣本,4～22號(hào)管/條的模板為非HBV病原體;BC的模板為蒸餾水;CL:控制線(xiàn);TL:檢測(cè)線(xiàn)。

2.4 HBV-RT-MCDA檢測(cè)在臨床標(biāo)本中的可行性評(píng)價(jià) 在83份疑似HBV感染患者的血漿樣本中,RT-PCR方法檢出45例陽(yáng)性樣本,這些陽(yáng)性樣本同樣被HBV-MCDA-LFB方法檢出(圖7)。此外,另有3份RT-PCR陰性的樣本被HBV-MCDA-LFB方法檢出。經(jīng)R軟件計(jì)算(表3),RT-PCR和HBV-MCDA-LFB 兩種方法的χ2值為0.097 805,P值為0.754 5,表明兩種方法的檢測(cè)能力沒(méi)有差異,具有較高的一致性。

利用HBV-MCDA-LFB檢測(cè)83份疑似HBV感染患者的血液樣本;CL:控制線(xiàn);TL:檢測(cè)線(xiàn)。

表3 HBV-MCDA-LFB和RT-PCR在臨床樣本中的HBV檢測(cè)能力的比較(n=83)

3 討論

病毒性肝炎是我國(guó)法定報(bào)告?zhèn)魅静?bào)告病例數(shù)最多的乙類(lèi)傳染病,其中約80%的病例是由HBV感染引起的[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)現(xiàn)有HBV攜帶者約7 000萬(wàn)人,其中約2 800萬(wàn)為慢性感染者,這些慢性感染者發(fā)生肝硬化、肝衰竭和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)較高,最終可能導(dǎo)致約70萬(wàn)人死亡[14]。HBV感染引起的病毒性肝炎是我國(guó)主要的衛(wèi)生挑戰(zhàn)。因此,建立快速準(zhǔn)確、靈敏特異的HBV檢測(cè)方法對(duì)我國(guó)預(yù)防、治療和控制HBV感染具有極其重要的作用。

近年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,核酸擴(kuò)增檢測(cè)(nucleic acid amplification test, NAT)技術(shù)因其靈敏度高、時(shí)效性好的特點(diǎn)在病原體檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn),HBV DNA是病毒復(fù)制和傳染性的直接標(biāo)志,在HBV感染后1個(gè)月即可檢出HBV DNA[15],因此HBV DNA檢測(cè)在HBV感染的控制、診斷和治療評(píng)價(jià)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[16-17]。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)是目前臨床最常用的HBV DNA檢測(cè)技術(shù)[18],然而,由于該方法需要昂貴的擴(kuò)增儀器以及嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件,且在極低濃度HBV DNA情況下容易出現(xiàn)漏檢的情況[19-21],因此無(wú)法在條件有限的基層和偏遠(yuǎn)地區(qū)以及病毒載量極低的感染者中普及應(yīng)用。

恒溫核酸擴(kuò)增是近幾年迅速發(fā)展且不依賴(lài)特殊實(shí)驗(yàn)設(shè)備和條件的核酸檢測(cè)技術(shù)[9],包括MCDA[9],環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)[22-23]、重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification, RPA)[24-25]等。與以PCR為基礎(chǔ)的核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法相比,恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)不需要高溫的模板熱變性過(guò)程,長(zhǎng)時(shí)間的溫度循環(huán)以及繁瑣的電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果,其擴(kuò)增可以在較低的恒定溫度下實(shí)現(xiàn),擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)可通過(guò)實(shí)時(shí)濁度儀、可視化染料或側(cè)向免疫層析法實(shí)現(xiàn),因此具有快速、簡(jiǎn)單、高特異性、高靈敏度、成本低廉的優(yōu)點(diǎn),在床旁檢測(cè)(point-of-care test, POCT)等領(lǐng)域具有強(qiáng)大的應(yīng)用前景[26]。本研究中所用的MCDA方法就是這樣一種新型等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[9]。目前,MCDA方法已經(jīng)用于SARS-Cov-2、猴痘等新發(fā)突發(fā)傳染病的檢測(cè)[27-28]。MCDA方法在恒溫條件下僅使用1種恒溫置換酶(Bst2.0)就可以實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增,具有擴(kuò)增度快、反應(yīng)靈敏、特異性高的特點(diǎn)[9-10]。在MCDA方法中,分別針對(duì)靶基因的10個(gè)區(qū)域的5對(duì)擴(kuò)增引物保證了該方法較高的特異性,經(jīng)驗(yàn)證,本研究中HBV-MCDA-LFB方法的特異性為100%。除了特異性高外,HBV-MCDA-LFB方法還具有高靈敏性的特點(diǎn)[10]。在本研究中,HBV-MCDA-LFB方法在30 min內(nèi)即可檢測(cè)到濃度低至10個(gè)拷貝的HBV質(zhì)粒。與Chen等[29]的報(bào)道相比,本研究在確保檢測(cè)靈敏度的同時(shí),將檢測(cè)時(shí)間從35 min縮短至30 min,提示其較高的擴(kuò)增效率。同時(shí),在臨床樣本的檢測(cè)能力評(píng)估中,HBV-MCDA-LFB方法的HBV檢出率也略高于RT-PCR,證明了HBV-MCDA-LFB方法的檢測(cè)能力與RT-PCR方法具有較高的一致性,可用于疑似HBV感染者的篩查和診斷。

金納米材料具有超強(qiáng)的吸附能力、良好的定向能力和生物兼容性,基于金納米材料的生物傳感器在醫(yī)學(xué)診斷、臨床檢測(cè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[27, 30-31]。本研究將LFB技術(shù)與MCDA方法相結(jié)合,能夠?qū)崿F(xiàn)HBV的簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。MCDA的擴(kuò)增產(chǎn)物可以用多種方法進(jìn)行分析檢測(cè),包括瓊脂糖凝膠法、比濁法和可視顏色變化法等[10-11]。然而,這些檢測(cè)方法需要特定的儀器進(jìn)行識(shí)別判讀,或者敏感性較低,容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。利用LFB方法檢測(cè)MCDA擴(kuò)增產(chǎn)物,不需要昂貴的儀器設(shè)備和復(fù)雜的操作過(guò)程,同樣可以實(shí)現(xiàn)MCDA產(chǎn)物的可視化檢測(cè),同時(shí)還有較高的靈敏度和特異性。

然而,本研究建立的HBV-MCDA-LFB方法也存在一定的局限性,如無(wú)法對(duì)樣本中的HBV載量進(jìn)行準(zhǔn)確定量、存在交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)等,這些缺陷將在未來(lái)的研究中進(jìn)行優(yōu)化和改良?？傊?本研究研究建立的HBV可視化檢測(cè)方法HBV-MCDA-LFB具有快速準(zhǔn)確、靈敏特異和操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn),在臨床檢測(cè)和HBV感染診斷中具有良好的應(yīng)用前景,尤其是在醫(yī)療資源匱乏的偏遠(yuǎn)地區(qū)。