諶洪俊,邵娜娜,2,陳昱江

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 治未病中心,貴州 貴陽(yáng) 550002;2.金沙縣中醫(yī)院 內(nèi)分泌科,貴州 畢節(jié) 551899;3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 病理科,貴州 貴陽(yáng) 550002)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)以不完全可逆的氣流受限為特點(diǎn),常呈進(jìn)行性發(fā)展。2014—2015年中國(guó) COPD 的總患病率為13.6%,表明該疾病已經(jīng)成為一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問題[1]?，F(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為肺氣虛是COPD的根本病機(jī),隨著肺氣虛的加重,漸致脾腎虛損,而脾土生肺金,肺金生腎水,肺上有脾母,下有腎子,肺病則上下不寧,導(dǎo)致COPD反復(fù)發(fā)作,發(fā)展成不可逆通氣功能障礙。對(duì)COPD患者,主要強(qiáng)調(diào)肺氣虛的治療,注重化痰活血,補(bǔ)中益氣。在益氣補(bǔ)肺活血化痰法指導(dǎo)下,我們以經(jīng)典方《永類鈐方》中的補(bǔ)肺湯為基礎(chǔ)方,組方參芪補(bǔ)肺湯,應(yīng)用于COPD患者的治療,取得較好療效[2]。但其分子生物學(xué)機(jī)制,目前尚不清楚。

巨噬細(xì)胞是多功能免疫細(xì)胞,在慢性炎癥狀態(tài)下,巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化增多,分泌大量的促纖維化細(xì)胞因子,如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子等,促進(jìn)細(xì)胞外膠原(extracelluar cell matrix, ECM)的沉積,但M2型巨噬細(xì)胞是否參與了COPD大鼠間質(zhì)性肺炎及參芪補(bǔ)肺湯是否通過(guò)調(diào)控M2巨噬細(xì)胞的滲出及功能發(fā)揮治療作用目前仍不清楚。

1 材料與方法

1.1 參芪補(bǔ)肺湯制作 參芪補(bǔ)肺湯水煎劑(由黃芪30 g、黨參15 g、補(bǔ)骨脂15 g、丹參30 g、百部15 g、桑白皮30 g、紫菀15 g組成),均一次購(gòu)自貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,方中藥物加水浸泡2 h,首煎煮沸30 min,次煎20 min,兩煎合一,紗布過(guò)濾后,裝入燒杯,放入40 ℃的恒溫水浴箱中濃縮,濃縮至含生藥4 g/mL,置冰箱保存。

1.2 動(dòng)物模型制作及干預(yù) COPD模型制作方法:受試大鼠分別在第1、14天氣道內(nèi)注入0.2 mg脂多糖,第2～28天(除第14天)在熏煙箱進(jìn)行煙熏。煙熏方法如下:大鼠分別放置于體積為 100 cm×70 cm ×70 cm 熏煙箱中,將8支香煙捆綁在點(diǎn)煙室點(diǎn)燃,通過(guò)通氣裝置將香煙煙霧注入熏煙箱內(nèi),對(duì)大鼠進(jìn)行被動(dòng)吸煙染毒,燃燒時(shí)間為30 min/次,2次/d。干預(yù)方法:11周齡雄性SD大鼠40只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(normal control group, NC)10只,COPD對(duì)照組(copd control group, CC)10只,正常治療組(normal treated group, NT)10只,COPD治療組(copd treated group, CT)10只。CT組及NT組按5.04 g/100 g體重/d劑量用參芪補(bǔ)肺湯灌胃治療,CC組及NC組大鼠以等量清水灌胃。4周后以2%戊巴比妥鈉溶液按50 mg/kg腹腔注射麻醉后處死大鼠。本研究通過(guò)貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 主要檢驗(yàn)方法及試劑 斷頸處死大鼠后,取肺組織進(jìn)行HE染色及Masson染色、行CD68、CD206免疫組化染色及每高倍視野下陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(每張切片計(jì)數(shù)10個(gè)不同的高倍視野并進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù))、行TGF-β1、Collagen-IV、Fibronectin的Western-blotting檢驗(yàn),所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。CD68、CD206、β-actin、TGF-β1一抗購(gòu)于北京博奧森生物科技有限公司;Collagen-Ⅳ及Fibronctin一抗購(gòu)置于英國(guó)Abcam公司提供,余試劑購(gòu)置于北京奧森生物科技有限公司。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠HE及Masson染色變化 HE染色示CC組大鼠支氣管上皮明顯增生,杯狀細(xì)胞顯著增多,部分上皮脫落,粘膜下成纖維細(xì)胞增生;管壁有大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn);部分肺泡腔擴(kuò)大,肺泡壁斷裂,肺間質(zhì)血管充血水腫,Masson染色示CC組大鼠肺間質(zhì)纖維化程度明顯加重,主要表現(xiàn)為肺間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)及纖維蛋白沉積增多(圖1)。

放大倍數(shù)×200。

2.2 各組大鼠CD68及CD206免疫組化染色變化 與NC組大鼠相比,CC組大鼠肺泡內(nèi)、肺血管周圍、肺間質(zhì)均見較多CD68(+)巨噬細(xì)胞滲出,且滲出巨噬細(xì)胞以表達(dá)CD206(+)M2巨噬細(xì)胞為主。經(jīng)參芪補(bǔ)肺湯治療后,CT組大鼠CD68(+)巨噬細(xì)胞滲出較CC組明顯減低,且CD206(+)M2巨噬細(xì)胞滲出也隨之明顯減低(圖2)。

A:免疫組化染色各組大鼠巨噬細(xì)胞滲出情況; B:直方圖示每高倍視野CD68(+)巨噬細(xì)胞及CD206(+)M2巨噬細(xì)胞滲出差別;#:與NC組比較,P<0.001; *:與CC組比較,P<0.001;NT:正常治療組;NC:正常對(duì)照組;CT組:COPD治療組;CC:COPD對(duì)照組;×200。

2.3 各組大鼠Collagen-Ⅳ、Fibronectin、TGF-β1等纖維化指標(biāo)的差異 與NC組大鼠相比,CC組大鼠Collagen-Ⅳ、Fibronectin、TGF-β1表達(dá)明顯增多。經(jīng)參芪補(bǔ)肺湯治療后,CT組大鼠肺組織較CC組大鼠肺組織纖維化指標(biāo)明顯減低(圖3)。

A:Westen-blotting示各組大鼠肺組織Collagen-Ⅳ、Fibronectin及TGF-β1表達(dá);B:直方圖示各組大鼠肺組織Collagen-Ⅳ、Fibronectin及TGF-β1表達(dá)的差別:*:與NC組比較,P<0.001;#:與CC組比較,P<0.005;NT:正常治療組;NC:正常對(duì)照組;CT組:COPD治療組;CC:COPD對(duì)照組。

3 討論

經(jīng)參芪補(bǔ)肺湯治療后,與模型組大鼠比較,治療組大鼠肺間質(zhì)血管充血減輕,肺泡結(jié)構(gòu)破壞減少。提示參芪補(bǔ)肺湯能減輕COPD大鼠肺組織病理?yè)p害,通過(guò)免疫組化染色提示M2巨噬細(xì)胞滲出在參芪補(bǔ)肺湯干預(yù)后有所減低,提示其治療作用可能部分是通過(guò)減少促纖維化M2巨噬細(xì)胞滲出而獲得的。

巨噬細(xì)胞是多功能免疫細(xì)胞,具有明顯異質(zhì)性:其在Th1型細(xì)胞因子(主要是干擾素-γ)或內(nèi)毒素的誘導(dǎo)下,分化為“經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞”,也稱為M1型細(xì)胞;其產(chǎn)生大量的促炎因子,擴(kuò)大炎癥反應(yīng),清除病原微生物。在Th2型細(xì)胞因子,主要是IL-4及IL-13的誘導(dǎo)下,可“替代活化”為M2細(xì)胞,其分泌大量的促纖維化細(xì)胞因子,促進(jìn)細(xì)胞外膠原(extracelluarcell matrix ,ECM)的沉積。

COPD患者肺泡巨噬細(xì)胞表征M1基因,如CXCL11,CXCL9,CCL4,CCL5較正常人明顯減低,在健康吸煙者肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中也發(fā)現(xiàn)促炎性細(xì)胞因子mRNA水平明顯減低,上述研究提示COPD患者巨噬細(xì)胞并非以M1為主。研究還發(fā)現(xiàn),COPD患者肺泡巨噬細(xì)胞M2相關(guān)基因,如MMP2、CCR2、TGF-β明顯升高,提示其可能參與了COPD肺間質(zhì)纖維化[3-6]。上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果類似,我們發(fā)現(xiàn)COPD大鼠肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞滲出增多,且以促纖維化的CD206(+)M2型巨噬細(xì)胞為主,導(dǎo)致TGF-β1等促纖維化因子增多,最終導(dǎo)致Collagen-Ⅳ及Fibronectin等細(xì)胞外基質(zhì)增多,參與了COPD大鼠不可逆的氣道重構(gòu)。

從中醫(yī)角度來(lái)看,COPD穩(wěn)定期以肺氣虛為主,故益氣補(bǔ)肺是其主要的治法,但痰瘀蘊(yùn)肺是主要病理因素,已有研究表明補(bǔ)氣活血方對(duì)肺氣虛證療效較單純使用補(bǔ)氣方或活血方更有效[7]。本實(shí)驗(yàn)研究所用的參芪補(bǔ)肺湯由《永類鈴方》中的補(bǔ)肺湯演變而來(lái),方中黃芪補(bǔ)氣為君,既能益肺固表,兼能健脾利水;黨參為臣藥, 補(bǔ)氣健脾,益氣生津;補(bǔ)骨脂為臣藥,溫補(bǔ)脾、腎之陽(yáng)、納氣平喘;丹參為佐藥,活血化瘀而不傷血;百部潤(rùn)肺止咳而宣肺;紫菀疏散肺氣郁滯,為佐使藥,全方七味藥相互配伍,共奏益氣補(bǔ)肺、活血化痰之功,使肺氣虛得補(bǔ),痰瘀得化,氣機(jī)暢達(dá),故咳喘自平,是臨床用于COPD治療的主要方劑之一[8]。

本研究有一定局限性。(1)未進(jìn)行細(xì)胞模型構(gòu)建及進(jìn)行相關(guān)機(jī)制驗(yàn)證;(2)無(wú)患者及健康對(duì)照者肺泡灌洗液進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證;(3)在對(duì)巨噬細(xì)胞型別鑒定方面,只使用了單色免疫組化,未使用CD68+CD206+免疫熒光共定位或流式細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)行精確鑒定,也缺乏對(duì)M2表達(dá)相關(guān)細(xì)胞因子的精準(zhǔn)分析;(4)由于未使用有效的巨噬細(xì)胞清除方法進(jìn)行干預(yù),尚不能得出參芪補(bǔ)肺湯通過(guò)抑制M2巨噬細(xì)胞滲出發(fā)揮抗纖維化作用的肯定結(jié)論,而只能證明有一定相關(guān)性。在未來(lái)研究中,我們將對(duì)上述缺陷進(jìn)行彌補(bǔ)。

綜上所述,M2巨噬細(xì)胞滲出可能參與了COPD大鼠間質(zhì)性肺炎的發(fā)生發(fā)展及氣道重構(gòu),而參芪補(bǔ)肺湯可能通過(guò)抑制M2巨噬細(xì)胞滲出、抑制促纖維化細(xì)胞因子的分泌而發(fā)揮治療作用。