陳文明,陳嘉敏,蹇明輝

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1.心血管內(nèi)科,2.兒科,3.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,貴州 遵義 563099)

目前,急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是心血管系統(tǒng)最常見、最危重的急癥之一,病情發(fā)展迅速且死亡率較高[1]。近年來,隨著經(jīng)皮冠狀動脈介入治療和溶栓治療得到不斷的發(fā)展,心肌梗死的救治成功率得到了顯著提高,但梗死后心肌的損傷以及心室的重構(gòu)嚴(yán)重影響心肌正常的舒縮功能[1-2]。因此,如何減輕心肌梗死患者的心肌損傷、改善心功能顯得尤為重要。近年來研究表明,中藥在心肌梗死方面的研究取得不錯(cuò)的效果。含有黃酮類化合物的中草藥是中醫(yī)藥防治心血管疾病的主要選擇之一。石上柏含有多種生物活性成分,包括雙黃酮、生物堿和有機(jī)酸等化合物,其中穗花杉雙黃酮是石上柏中主要的雙黃酮類化合物,具有抗炎、抗氧化、抗病毒及改善心腦血管的藥理作用[3-4]。有文獻(xiàn)報(bào)道,穗花杉雙黃酮對心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用[5],那么其對AMI是否有影響。基于此,本文通過建立大鼠AMI模型,探究穗花杉雙黃酮對AMI模型大鼠心功能及心肌纖維化的影響,為穗花杉雙黃酮應(yīng)用于臨床提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取健康雄性Sprague Dawley大鼠60只,體重為(300±20)g,由遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,動物使用合格證號:SYXK(黔)2021-0004。動物飼養(yǎng)于安靜、通風(fēng)良好和有空氣過濾系統(tǒng)的環(huán)境中,動物飼養(yǎng)室內(nèi)溫度:(22.0±2.0)℃,相對濕度:(40.0±5.0)%。本實(shí)驗(yàn)遵守實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理有關(guān)準(zhǔn)則。動物倫理委員會批準(zhǔn)號:KLL-2021-128。

1.1.2 主要試劑與儀器 穗花杉雙黃酮(純度>98%,批號:160523)購自成都瑞芬恩科技有限公司;Ⅰ型前膠原蛋白的羧基末端肽(carboxy-terminal peptide of type Ⅰ procollagen, PⅠCP)、Ⅲ型前膠原蛋白的氨基末端肽(amino terminal peptide of type Ⅲ procollagen, PⅢNP)試劑盒、兔抗轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1),基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)多克隆抗體等均購于成都海利源生物科技有限公司;MMP-2和TGF-β1引物、Real-Time PCR試劑盒和RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于寶生物工程(大連)有限公司;IX-73型顯微鏡購自日本 OLYMPUS公司;PowerPac通用電泳儀購自美國BIO-RAD公司;iE33型心臟超聲儀購自Philips公司;ALC-V8S-621型小動物呼吸機(jī)購自上海奧爾特公司;CFX96 型PCR儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組,模型組,穗花杉雙黃酮低劑量組(50 mg/kg),穗花杉雙黃酮高劑量組(100 mg/kg),每組15只(n=15,其中用于HE和Masson染色,n=5;用于mRNA和蛋白檢測,n=10)。穗花杉雙黃酮的給藥劑量是依據(jù)文獻(xiàn)[5],并結(jié)合前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定。采用左前降支冠狀動脈結(jié)扎法建立心肌梗死模型,建模成功后,待大鼠清醒后,當(dāng)天開始灌胃給藥,假手術(shù)和模型兩個(gè)組給予等量生理鹽水,連續(xù)28 d。

1.2.2 建立心肌梗死模型 本實(shí)驗(yàn)大鼠AMI模型制備參照本課題組前期的實(shí)驗(yàn)方法[6]。大鼠用異氟烷吸入麻醉,然后固定于手術(shù)臺上,剪開頸部皮膚,行氣管分離,剪開氣管,氣管插管后固定,連接小型動物呼吸機(jī)。設(shè)置呼吸機(jī)參數(shù),潮氣量:12 mL/kg,呼吸頻率:30～45次/min,吸呼頻率比為1∶1。四肢皮下插入電極,連接BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),觀察標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖(Ⅱ?qū)?lián))。于胸骨左緣第3、4肋間打開胸腔,撕開心包,使心臟充分暴露;于肺動脈圓錐與左心耳根部交叉點(diǎn)順左冠狀靜脈下方約1 mm處為結(jié)扎點(diǎn),用6.0的無損傷縫合線結(jié)扎左冠脈前降支(進(jìn)針深度約1.5 mm),結(jié)扎冠脈供血區(qū)域心肌因缺血而變蒼白,心電圖II導(dǎo)聯(lián)ST段明顯抬高和出現(xiàn)Q波,則模型建立成功。為了預(yù)防感染,術(shù)后5 d內(nèi),每天給予大鼠肌肉內(nèi)注射青霉素30萬U。假手術(shù)組僅在大鼠心臟左冠脈前降支同一位置穿線,不結(jié)扎,其余操作方法同上。

1.2.3 心功能測定 給藥處理28 d后,麻醉大鼠,用心臟超聲儀對大鼠心臟進(jìn)行檢測并記錄左室收縮末內(nèi)徑(left ventricular end systolic dimension, LVESD)、左室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end diastolic dimension, LVEDD)、左室縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular fractional shortening, LVFS)和左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)連續(xù)檢測 3 次心臟周期,計(jì)算平均值[6]。

1.2.4 用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immun osorbent assay, ELISA)測定血清中膠原代謝產(chǎn)物PⅠCP和PⅢNP的表達(dá)水平 給藥處理28 d后,麻醉大鼠,分離頸總動脈,采取動脈血,將其離心處理后,收集血清,根據(jù)ELISA 試劑盒方法檢測血清中膠原代謝產(chǎn)物PⅠCP和PⅢNP的表達(dá)水平[6]。

1.2.5 蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin, HE)、Masson染色 大鼠經(jīng)頸總動脈采血后,快速打開胸腔,于下腔靜脈注射10%氯化鉀(3 mL/kg),使心臟在舒張期停搏后,取出心臟,放置于4%多聚甲醛固定24 h,然后進(jìn)行石蠟包埋。石蠟經(jīng)切片后,進(jìn)行HE和Masson染色。在顯微鏡下觀察心肌形態(tài)學(xué)變化和心肌纖維化程度,每張切片分別選取4～6個(gè)不重復(fù)視野并于高倍鏡下拍照[6]。

1.2.6 Real-time PCR檢測MMP-2和TGF-β1的mRNA表達(dá)情況 大鼠經(jīng)頸總動脈采血后,快速打開胸腔,取出大鼠心臟,去除發(fā)白梗死區(qū)域部分,留取心臟梗死邊緣區(qū)心肌組織。用TRIzol試劑提取心肌組織中總RNA,然后用PrimeScript RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用Bio-Rad CFX96定量PCR系統(tǒng)和SYBR green mix進(jìn)行RT-PCR。PCR的條件包括:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,使用GAPDH進(jìn)行歸一化,采用2(-ΔΔCt)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[7]。引物序列(表1)。

表1 引物序列

1.2.7 使用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)法檢測MMP-2、TGF-β1的蛋白表達(dá)情況 大鼠經(jīng)頸總動脈采血后,快速打開胸腔,取出大鼠心臟,去除發(fā)白梗死區(qū)域部分,留取心臟梗死邊緣區(qū)心肌組織。用含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液裂解心肌組織,提取總蛋白。用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法檢測心肌組織蛋白濃度,確定蛋白質(zhì)上樣量后,通過凝膠電泳對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離;用濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上;在室溫條件下,用5%脫脂奶粉封閉 1 h;加入稀釋的一抗(MMP-2和TGF-β1按1∶200稀釋、GAPDH按1∶1 000稀釋)溶液,4 ℃孵育過夜;加入二抗溶液,在室溫條件下孵育1 h,加入化學(xué)發(fā)光劑,采用全自動凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照,利用 Gel-Pro analyzer軟件分析目的蛋白的表達(dá)變化。

2 結(jié)果

2.1 AMI大鼠心電圖變化 心電圖結(jié)果顯示:與假手術(shù)相比,模型組大鼠心電圖ST 段抬高,呈“弓背向上”型,說明大鼠急性心肌梗死模型建立成功(圖1)。

A:假手術(shù)組;B:模型組。

2.2 穗花杉雙黃酮對AMI大鼠心功能及相關(guān)指標(biāo)的影響 心臟超聲結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠左心室前壁運(yùn)動明顯減弱,室壁明顯變薄,左心室腔徑明顯增大,LVEF、LVFS值明顯降低(P<0.05),LVESD、LVEDD值顯著升高(P<0.05),心功能惡化;與模型組比較,穗花杉雙黃酮低、高劑量組大鼠左心室前壁運(yùn)動顯著增強(qiáng),室壁明顯增厚,腔徑顯著縮小,擴(kuò)張程度明顯減輕,LVEF、LVFS值顯著升高(P<0.05),LVESD、LVEDD值明顯降低(P<0.05),心功能明顯改善(圖2、表2)。

A:假手術(shù)組;B:模型組;C:穗花杉雙黃酮低劑量組;D:穗花杉雙黃酮高劑量組。

表2 穗花杉雙黃酮對AMI大鼠LVEF、LVFS、LVEDD和LVESD的影響

2.3 穗花杉雙黃酮對AMI大鼠心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 HE染色結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心臟梗死區(qū)域心肌組織大多被瘢痕組織所替代,細(xì)胞核發(fā)生固縮或溶解,存活的心肌細(xì)胞較少,呈排列松散、凌亂狀態(tài);與模型組相比,穗花杉雙黃酮低、高劑量組大鼠左心室梗死區(qū)域心肌瘢痕組織明顯減少,存活心肌細(xì)胞明顯增多(圖3)。

圖3 穗花杉雙黃酮對AMI大鼠心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

Masson 染色結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠左心室梗死區(qū)有大量的藍(lán)色膠原纖維,呈條索狀,部分膠原纖維融合;與模型組比較,穗花杉雙黃酮低、高劑量組大鼠左心室梗死區(qū)域藍(lán)色膠原纖維明顯減少(圖3)。

2.4 穗花杉雙黃酮對AMI大鼠血清中PⅠCP和PⅢNP表達(dá)的影響 ELISA檢測結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清中PⅠCP和PⅢNP蛋白水平均增強(qiáng)(P<0.05);與模型組比較,穗花杉雙黃酮低、高劑量組大鼠血清中PⅠCP和PⅢNP蛋白濃度明顯降低(P<0.05,表3)。

表3 穗花杉雙黃酮對AMI大鼠血清中PⅠCP和PⅢNP表達(dá)的影響

2.5 穗花杉雙黃酮對AMI大鼠心肌組織MMP-2和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平的影響 Real-time PCR檢測結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠心肌組織MMP-2和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,穗花杉雙黃酮低、高劑量組大鼠心肌組織MMP-2和TGF-β1的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05,表4)。

表4 穗花杉雙黃酮對AMI大鼠心肌組織MMP-2和TGF-β1 mRNA表達(dá)水平的影響

2.6 穗花杉雙黃酮對AMI大鼠心肌中MMP-2和TGF-β1的蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)MMP-2和TGF-β1的蛋白水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,穗花杉雙黃酮低、高劑量組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)MMP-2和TGF-β1的蛋白水平顯著降低(P<0.05,圖4、表5)。

圖4 穗花杉雙黃酮對AMI大鼠心肌中MMP-2和TGF-β1的蛋白水平的影響

表5 穗花杉雙黃酮對AMI大鼠心肌中MMP-2和TGF-β1蛋白水平的影響

3 討論

研究數(shù)據(jù)顯示,心血管疾病仍是全球死亡的主要原因之一,約有1 790萬人死于心血管疾病,占全球死亡人數(shù)的31%[8]。據(jù)估計(jì),到 2030 年死亡人數(shù)將增加到 2 360 萬以上[9]。AMI為一種嚴(yán)重的心血管疾病,是引起心源性休克的主要原因,占80%以上[10]。AMI后引起不同程度的左心室重構(gòu),常使冠脈血流量減少,心肌纖維化加劇,心功能惡化,使患者的臨床癥狀和預(yù)后無根本改善[11]。AMI 后的心肌纖維化對患者的生存至關(guān)重要。因此,延緩或預(yù)防心肌纖維化是防治AMI后心室重構(gòu)和心力衰竭的關(guān)鍵。

目前,在臨床上,心臟超聲是評估心功能的常規(guī)方法,在心肌梗死的診斷中扮演著非常重要的角色[2]。在本研究中,心動超聲圖結(jié)果所示,在造模28 d后,大鼠左心室室壁運(yùn)動幅度、室壁厚度明顯低于正常大鼠,且LVESD、LVEDD值明顯升高,LVEF值明顯降低,與以往研究一致[6];連續(xù)給予穗花杉雙黃酮處理 28 d后,發(fā)現(xiàn)大鼠心肌梗死后左心室室壁運(yùn)動幅度明顯增強(qiáng),室壁增厚,LVESD、LVEDD值明顯降低,LVEF值明顯回升,表明穗花杉雙黃酮可有效改善心肌梗死后大鼠的心功能。

心肌梗死后,受損的心肌組織在缺血缺氧條件下,引起局部心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡,增強(qiáng)了心肌成纖維細(xì)胞的增殖能力,以膠原纖維為主的細(xì)胞外基質(zhì)增多,并過量沉積,各型膠原比例失調(diào),導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生[12]。心肌纖維化過程同時(shí)伴隨著多種心肌膠原代謝相關(guān)產(chǎn)物(如:PⅠCP、PⅢNP等)的增加。PⅠCP和 PⅢNP 是心?、裥秃廷笮湍z原的前體多肽,是前膠原轉(zhuǎn)換為膠原過程中脫離前膠原的游離肽段,其隨膠原纖維合成的增加而增加[12]。近年來研究表明,在大鼠心肌梗死模型血清中PⅠCP 和PⅢNP的表達(dá)高于正常對照組[6],另外,在心肌梗死患者PⅠCP 和PⅢNP的表達(dá)也明顯高于正常人群[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組大鼠血清中PⅠCP 和PⅢNP表達(dá)明顯高于假手術(shù)組,在連續(xù)給予穗花杉雙黃酮處理 28 d后,心肌梗死大鼠血清中PⅠCP 和PⅢNP表達(dá)明顯降低,結(jié)合HE染色結(jié)果,表明穗花杉雙黃酮能抑制大鼠心肌梗死后心肌纖維化。

心肌梗死后,神經(jīng)體液發(fā)生異常,進(jìn)而刺激心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞合成分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)[14-15]。MMP被絲氨酸蛋白酶、纖溶酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、激肽及組織蛋白酶G等激活后降解基質(zhì)膠原,使心肌失去基質(zhì)膠原支持并出現(xiàn)排列紊亂。有研究表明,MMP2在心肌梗死后迅速上調(diào),加速膠原代謝,促進(jìn)心肌纖維化[15]。在心肌纖維化過程中,TGF-β1參與了調(diào)節(jié)心臟成纖維細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組大鼠心肌組織中MMP-2、TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組,在連續(xù)給予穗花杉雙黃酮處理28 d 后,發(fā)現(xiàn)心肌組織中MMP-2、TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均呈不同程度的降低。表明穗花杉雙黃酮能降低大鼠心肌梗死后心肌纖維化可能與下調(diào)MMP-2、TGF-β1的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述,穗花杉雙黃酮能夠改善心肌梗死大鼠心肌纖維化,進(jìn)而改善心功能,該作用可能與抑制MMP-2、TGF-β1的表達(dá)有關(guān)。