劉曉曦,羅 杰,劉大海,何思思,周建國,柏玉舉,馬 虎

(1.遵義醫(yī)科大學 第一臨床學院,貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 規(guī)培科,貴州 遵義 563099;3.遵義醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 胸部腫瘤科,貴州 遵義 563006)

癌癥是全球主要死亡原因之一[1],據(jù)中國癌癥登記年報2022年數(shù)據(jù)顯示,目前我國最常見的惡性腫瘤仍是肺癌,同時也是中國癌癥死亡的最主要原因[2]。根據(jù)病理學類型通常將肺癌分為小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),其中NSCLC約占肺癌的85%[1]。近年來隨著醫(yī)學技術(shù)的發(fā)展,分子靶向治療(molecular targeted therapy)已廣泛應用于各種惡性腫瘤,基于其在臨床中取得的顯著療效,成功地開創(chuàng)了晚期惡性腫瘤精準治療的新時代,特別是攜帶EGFR突變的分子靶向治療更為常見[3]。在驅(qū)動基因突變的晚期NSCLC患者一線使用療效顯著優(yōu)于傳統(tǒng)化療[4]。近年來用于EGFR突變IB-IIIA期NSCLC患者的術(shù)后輔助治療[5]也獲得不俗的療效而被多個國家指南推薦使用。但不幸的是用藥過程中均不可避免出現(xiàn)耐藥,進一步探索EGFR-TKIs耐藥的機制,找到特異性的耐藥靶點從而克服耐藥的發(fā)生成為臨床之需。

近來諸多的研究證明LncRNA對于調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展和耐藥起著極其重要的作用[6-7],大量證據(jù)表明LncRNA 可參與 microRNA(miRNA)功能的調(diào)控[8-9],而miRNA能夠在轉(zhuǎn)錄后水平對其靶基因進行負調(diào)控[10]。國內(nèi)外研究證實,miRNA 不但在維持癌干細胞惡性表型中起重要作用,在耐藥調(diào)控中也扮演著十分重要的角色[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn) MALAT1 可調(diào)節(jié) miR-125a-5p的表達促進腫瘤干細胞的功能從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13-14]。

我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)MALAT1在肺腺癌耐藥細胞中高表達而miR-125a-5p低表達,同時Rab25表達上調(diào),并且運用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證了MALAT1與miR-125a-5p有直接結(jié)合位點,Rab25基因是miR-125a-5p直接作用的靶基因,進一步發(fā)現(xiàn)MALAT1通過調(diào)控miR-125a-5p及其靶基因Rab25參與第一代EGFR-TKI耐藥[15-17]。本研究通過將過表達MALAT1的PC9細胞注入裸鼠皮下成瘤,在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)MALAT1通過調(diào)控miR-125a-5p及其靶基因Rab25參與第一代EGFR-TKI耐藥,有望為逆轉(zhuǎn)NSCLC的厄洛替尼耐藥提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 BALB/c-nu雄性裸鼠,4周齡,14～16 g,SPF級包裝,均購自北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號為 SCXK(京)2019-0008),分為兩組,A組接種PC9 細胞,B組接種PC9-MALAT1細胞(每組5只)。裸鼠飼養(yǎng)條件:于遵義醫(yī)科大學基礎藥理教育部重點實驗室SPF級動物房[許可證號:SYXK(黔)2018-0005],12 h/12 h晝夜交替,室溫(23±1)℃,濕度50%～60%,實驗期間自由獲取水和食物。本實驗已獲遵義醫(yī)科大學動物倫理委員會批準(編號:倫審[2016]1-002號)。

1.1.2 材料 人肺腺癌PC9細胞(EGFR 19外顯子缺失突變且對厄洛替尼敏感)惠贈于重慶陸軍軍醫(yī)大學,經(jīng)SAM(synergistic activasion mediator)雙載體(上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司)技術(shù)過表達MALAT1的PC9細胞(PC9-MALAT1)由本課題組構(gòu)建。SAM技術(shù)是通過兩個慢病毒分別向細胞中導入dCAS9-VP64蛋白和sgRNA-MS2-P65-HSF1序列表達框,從而實現(xiàn)對目的基因的過表達,其中CAS9蛋白載體用嘌呤霉素標記,sgRNA帶有新霉素抗性。RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hyclon公司);厄洛替尼(Erlotinib上海騰準生物科技有限公司);PBS緩沖液、胰蛋白酶、青鏈霉素、谷氨酰胺(北京索萊寶科技有限公司);RNAiso Plus試劑盒、qRT-PCR試劑盒(大連TaKaRa生物工程有限公司);二甲苯(成都科龍化工試劑廠);蘇木素染液、伊紅染色、中性樹膠、4%多聚甲醛、RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒、TBS、吐溫20(北京索萊寶科技有限公司);牛血清白蛋白(BBI Life Science公司);PVDF膜(0.22 μm)(美國Millipore公司);氯仿、無水乙醇、甲醛、異丙醇(上?；瘜W試劑有限公司);兔抗人Rab25抗體(上海愛必信科技生物有限公司);ECL曝光液(北京索萊寶科技有限公司);3%過氧化氫消毒液(安捷高科消毒科技有限公司);檸檬酸鹽抗原修復液、山羊血清、Ki67免疫組化一抗、HRP標記的山羊抗兔二抗、組化試劑盒DAB顯色劑(武漢塞維爾生物科技有限公司);CO2孵箱、熒光定量PCR儀、低溫高速離心機(賽默飛世爾科技有限公司);穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、曝光儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及計數(shù)收集 人肺腺癌PC9細胞、SAM雙載體轉(zhuǎn)染PC9-MALAT1細胞于含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%青-鏈霉素雙抗RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)(孵箱條件:溫度37 ℃、相對濕度95%、5% CO2),PC9-MALAT1細胞還需另外加125 μg/mL的新霉素維持。在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況及細胞匯合度,肉眼觀察細胞培養(yǎng)基顏色變化來確定是否更換培養(yǎng)基,一般為24～48 h更換1次,更換培養(yǎng)基時,用37 ℃ PBS 4～5 mL將細胞清洗3遍,完全吸盡PBS后再加入新培養(yǎng)基,選擇對數(shù)期生長良好的細胞收集計數(shù)并用生理鹽水重懸為5×107個/mL的單細胞懸液。

1.2.2 裸鼠移植瘤模型的建立與移植瘤剝除 將濃度為5×107個/mL的單細胞懸液,對應地接種于A、B組裸鼠的右側(cè)肩部,每只裸鼠接種0.1 mL,A組接種PC9 細胞,B組接種PC9-MALAT1細胞。1周后裸鼠全部成瘤,成瘤率為100%。待移植瘤體積平均達100 mm3予厄洛替尼(50 μg/g)灌胃治療,灌胃體積為0.1 mL/10 g,每天灌胃1次,連續(xù)2周。灌胃處理后正常喂養(yǎng),每天觀察裸鼠生長狀態(tài)及厄洛替尼的抗腫瘤情況,每2天稱量裸鼠體重及測量瘤體長徑a及短徑b并計算體積V=(a×b2)/2。2周后,頸椎脫臼法處死裸鼠并拍照,完整剝?nèi)×鲶w,拍照并稱量瘤體重量(全程于冰上)。每個移植瘤組織分為3份,其中1份用4%多聚甲醛固定24 h,用于HE染色及免疫組織化學實驗,另外2份保存于-80 ℃冰箱中用于相關(guān)RNA和蛋白的檢測。

1.2.3 裸鼠移植瘤HE染色 10%多聚甲醛固定24 h,脫水后進行石蠟包埋、切片,切片厚度為4 μm,于60 ℃烘箱中烤片30～40 min以備用。經(jīng)脫蠟、復水、蘇木素核染色、鹽酸酒精分化、伊紅細胞質(zhì)染色、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片,光學顯微鏡觀察腫瘤組織病理類型。

1.2.4 免疫組織化學檢測移植瘤中Ki67蛋白表達水平 石蠟切片經(jīng)脫蠟、復水、3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、檸檬酸鹽抗原修復、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液孵育、DAB顯色、蘇木素復染細胞核、鹽酸酒精分化、脫水中性樹膠封片,顯微鏡鏡檢,圖像采集并用Image J軟件進行Ki67蛋白相對表達量分析(設定閾值行陽性區(qū)域面積的比值計算相對表達量)。

1.2.5 qRT-PCR檢測移植瘤組織中MALAT1、miR-125a-5p、Rab25 mRNA表達水平 稱取50 mg各組移植瘤組織,充分研磨后用RNAiso Plus試劑盒提取總RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄,再將cDNA進行擴增。MALAT1的引物為GAPDH,miR-125a-5p的引物為U6,Rab25的引物為β-actin。MALAT1逆轉(zhuǎn)錄分兩步,首先在冰上配置逆轉(zhuǎn)錄反應體系一(RT-Primer Mix:2 μL、RNase free ddH2O:6 μL、總RNA:4 μL,800 ng)。反應條件:70 ℃ 10 min后在冰上急冷5 min。第1步反應期間在冰上配置好逆轉(zhuǎn)錄反應體系二(5×M-MLV Buffer:4 μL、dNTP Mixture:1 μL、RNase Inhibitor:0.5 μL、RTase M-MLV(RNase H-): 0.5 μL、RNase free ddH2O: 2 μL),然后加入到反應后的體系一中混勻進行第2步反應,反應條件:30 ℃ 10 min、42 ℃ 1 h、70 ℃ 15 min。miR-125a-5p及Rab25逆轉(zhuǎn)錄反應條件:42 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ ∞。qRT-PCR反應條件:95 ℃ 5 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,共循環(huán)40次,qRT-PCR相關(guān)引物及序列見表1。根據(jù)2-△△Ct分析法計算各目的基因相對表達量。

表1 qRT-PCR相關(guān)引物及序列

1.2.6 Western blot檢測移植瘤組織中Rab25蛋白表達變化 稱取50 mg移植瘤組織,充分研磨后加裂解液提取總蛋白,并用BCA法測定蛋白濃度。將提取的蛋白溶液與緩沖液混勻后進行煮沸變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗孵育、洗膜、曝光顯影、數(shù)據(jù)分析采用Quantity One 軟件(Bio-Rad Laboratories)對條帶的灰度值進行計算,利用目的蛋白灰度值比上β-Actin的灰度值的算法得到樣本的蛋白相對值。

2 結(jié)果

2.1 過表達MALAT1后移植瘤對Erlotinib的敏感性降低 培養(yǎng)PC9及PC9-MALAT1細胞,接種于裸鼠皮下后裸鼠全部成瘤(成瘤率100%),待移植瘤平均體積達100 mm3用Erlotinib連續(xù)灌胃治療2周(圖1)。治療期間觀察移植瘤發(fā)現(xiàn)PC9-MALAT1組的移植瘤對厄洛替尼的敏感性比PC9組降低,差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05,圖2)。各組之間裸鼠體重變化幅度大不,差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05,圖3)。連續(xù)灌胃2周后頸椎脫臼法處死裸鼠(圖4A),剝離移植瘤瘤體(圖4B)。測量PC9+Erlotinib、PC9-MALAT1+Erlotinib組移植瘤體積分別為(207.72±89.75、293.82±85.36)mm3(圖4C),移植瘤重量分別為(0.31±0.07、0.41±0.18)g(圖4D),表明過表達MALAT1后移植瘤對Erlotinib的敏感性降低,表現(xiàn)為移植瘤體積更大,差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05);重量更重,差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。進一步對移植瘤組織進行病理類型鑒定,HE染色顯示均為腺癌成分(圖5A)。免疫組織化學技術(shù)檢測移植瘤組織中Ki67的蛋白表達情況, PC9-MALAT1+Erlotinib組較PC9+Erlotinib組Ki67的表達量增加,差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05,圖5B)。以上結(jié)果說明過表達MALAT1后移植瘤對厄洛替尼治療的敏感性降低。

圖1 異種移植瘤模型的建立及治療示意圖

*:與PC9+Erlotinib組比較,P < 0.05

A:裸鼠成瘤情況;B:裸鼠成瘤大體標本;C:移植瘤體積;D:移植瘤重量;*:與PC9+Erlotinib組比較,P < 0.05。

A:移植瘤組織HE染色;B:移植瘤組織中Ki67蛋白相對表達量;*:與PC9+Erlotinib組比較,P < 0.05。

2.2 MALAT1過表達抑制移植瘤組織miR-125a-5p及促進Rab25的表達 通過qRT-PCR實驗檢測移植瘤組織中對應RNA相對表達差異(圖6)。MALAT1的表達情況在PC9-MALAT1+Erlotinib組較PC9+Erlotinib 組表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05,圖6A)。miR-125a-5p表達水平在PC9-MALAT1+Erlotinib組較PC9+Erlotinib組表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05,圖6B)。Rab25表達水平在PC9-MALAT1+Erlotinib組較PC9+Erlotinib組表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05,圖6C)。Western blot檢測結(jié)果顯示Rab25在PC9-MALAT1+Erlotinib組較PC9+Erlotinib組表達增加,差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05,圖7)。

A:MALAT1在移植瘤中的表達;B:miR-125a-5p在移植瘤中的表達;C:Rab25在移植瘤中的表達;*:與PC9+Erlotinib組比較,P< 0.05。

*:與PC9+Erlotinib組比較,P < 0.05。

3 討論

盡管肺癌分子靶向治療對基因突變患者有良好的臨床療效和疾病控制率,但這些患者平均在一年左右會出現(xiàn)對EGFR-TKIs的耐藥[18],這嚴重制約其臨床療效,影響了患者的總生存期。通常EGFR-TKIs的耐藥分為原發(fā)性和繼發(fā)性,其中原發(fā)性耐藥占30%左右,而大部分患者都為繼發(fā)性耐藥。原發(fā)性耐藥是指患者第1次使用就沒有療效,并且其耐藥機制研究相對清楚,而繼發(fā)性耐藥通常由EGFR依賴性二次突變(如T790M突變)和EGFR非依賴性(繞過EGFR信號傳導的旁路激活和組織學或表型轉(zhuǎn)化的突變等)所導致[3]。其中最常見的EGFR T790M突變占比60%,是EGFR 20號外顯子第790位點上的蘇氨酸被甲硫氨酸取代,導致氨基酸發(fā)生改變后EGFR-TKI對藥物的結(jié)合作用受限,引起下游相關(guān)信號通路的變化,從而產(chǎn)生獲得性耐藥[19]。目前針對T790M突變患者可口服第三代EGFR-TKIs,包括奧西替尼、伏美替尼及阿美替尼等,可使經(jīng)EGFR-TKI治療后出現(xiàn)進展攜帶T790M突變的NSCLC患者生存獲益[20]。而EGFR罕見突變也占到了10%,如Asp761Tyr、Thr854Ala及Leu747Ser等靶點[21]。然而對于第一和/或第二代EGFR-TKIs耐藥后目前無明確突變靶點的NSCLC肺癌患者,尋找與耐藥相關(guān)的分子標志物逆轉(zhuǎn)其耐藥是我們急需解決的臨床問題。

非編碼RNA已被證實在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及耐藥中起重要作用,其中LncRNA的異常表達與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[22-23]。LncRNA MALAT1長6.7kb,位于11q13.1也被稱為NEAT2(核豐富聚集的轉(zhuǎn)錄本2),不編碼蛋白質(zhì),首次發(fā)現(xiàn)于非小細胞肺癌的研究中[24]。有研究表明MALAT1通過調(diào)控miR-3129-5p/Nova1軸介導肝癌阿霉素耐藥[25]。同時有研究顯示,MALAT1通過靶向miR-618/MAEL調(diào)控腫瘤EMT過程從而導致肝癌對表阿霉素的耐藥性[26]。此外有研究已證明MALAT1可調(diào)節(jié)NSCLC細胞的藥物敏感性[27]。同時有研究表明,在乳腺癌中MALAT1高表達,且參與乳腺癌對阿霉素的耐藥[28]。有研究顯示在直腸癌中降低MALAT1的表達可逆轉(zhuǎn)其對奧沙利鉑的耐藥[29]。本研究中,將PC9細胞過表達MALAT1后,移植瘤的體積更大(P< 0.05)、重量更重(P< 0.05)、Ki67表達量增加(P< 0.05),對厄洛替尼的敏感性降低。

有大量證據(jù)表明在表觀遺傳學調(diào)控中扮演重要角色的LncRNA,參與調(diào)控miRNA的表達[30-31],而miRNA是一種小的非編碼RNA包含20～23個核苷酸分子,它通常結(jié)合靶基因3′UTR(非翻譯區(qū))的互補序列,影響基因的表達。有研究顯示LncRNA MALAT1通過調(diào)控miR-142-3p導致卵巢癌對氟尿嘧啶及順鉑的化療耐藥[9]。同時多項研究顯示,長鏈非編碼RNA MALAT1與微小RNA miR-125a-5p對于多種腫瘤的耐藥及發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[32-33]。Li等[34]研究發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤中MALAT1高表達與患者的預后及總生存期呈負相關(guān)。同時有些研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-125a-5p能抑制人骨肉瘤細胞對阿霉素的耐藥[35]。為了闡明MALAT1與miR-125a-5p在NSCLC中的表達及作用關(guān)系,基于我們之前的工作發(fā)現(xiàn)在PC9及PC9厄洛替尼耐藥細胞株(PC9/ER)中,MALAT1于耐藥細胞中高表達而miR-125a-5p低表達,并且利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證了MALAT1與miR-125a-5p有直接結(jié)合位點[15]。在這項研究中我們用體外構(gòu)建的MALAT1過表達PC9細胞(PC9-MALAT1)皮下注射裸鼠成瘤,并用Erlotinib灌胃治療,發(fā)現(xiàn)相較于親本PC9細胞移植瘤組,過表達MALAT1后移植瘤中miR-125a-5p表達量降低(P< 0.05),為過表達MALAT1可降低miR-125a-5p表達量進一步提供了體內(nèi)實驗證據(jù)。

Rab25是一種受體循環(huán)蛋白,據(jù)報道在具有侵襲表型和化療耐藥的腫瘤中增強,有研究表明Rab25參與非小細胞肺癌及腎細胞癌的耐藥[36-37]。另外有研究顯示Rab25在直腸癌化療耐藥細胞中低表達且與多藥耐藥標志物ABCB1、ABCC1及ABCG2呈負相關(guān),上調(diào)Rab25可增強順鉑對耐藥細胞G0/G1期的阻滯,顯著降低結(jié)直腸癌耐藥細胞株的化療耐藥性[38],這與本研究NSCLC厄洛替尼耐藥細胞中Rab25表達升高相反。并且有證據(jù)表明Rab25在NSCLC厄洛替尼獲得性耐藥細胞中高表達且起著促進耐藥的作用[39]。同時有研究顯示,在卵巢癌中Rab25通過改變卵巢癌細胞的線粒體凋亡信號而導致化療耐藥[40]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)Rab25作為miR-125a-5p的靶基因,miR-125a-5p通過調(diào)控靶基因Rab25及PI3K/AKT信號通路導致了NSCLC對厄洛替尼的耐藥[16-17]。本研究在移植瘤模型中發(fā)現(xiàn),過表達MALAT1后移植瘤中Rab25表達升高。綜上所述,過表達MALAT1可使miR-125a-5p表達下降、Rab25表達升高并且對Erlotinib產(chǎn)生耐藥,為MALAT1調(diào)控miR-125a-5p及Rab25參與厄洛替尼耐藥進一步提供了體內(nèi)實驗證據(jù)。但miR-125a-5p及Rab25是否與細胞周期及線粒體凋亡信號相關(guān)而誘發(fā)耐藥尚需進一步驗證。

雖然MALAT1調(diào)控miR-125a-5p及Rab25導致NSCLC厄洛替尼耐藥的具體機制未完全明確,尚需進一步實驗深入研究。總的來說,我們的研究結(jié)果表明,過表達MALAT1能在一定程度上降低PC9細胞裸鼠移植瘤對Erlotinib的敏感性,其機制可能與LncRNA MALAT1通過調(diào)控miR-125a-5p及其靶基因Rab25有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明,MALAT1可能作為肺癌精準治療的潛在靶點和新型生物標志物。