吳明鋒,韓曉艷,郭建磊,張士忠

缺血缺氧性腦損傷是新生兒較為常見的疾病,其臨床病死率高達75 %,也是目前新生兒死亡、小兒腦癱及其他中樞神經系統(tǒng)損害的主要原因,嚴重威脅新生兒生命健康[1]。研究[2]認為,大腦缺血缺氧影響神經突結構和神經元極性,神經系統(tǒng)損傷是缺血缺氧性腦損傷的主要原因。因此,探究影響神經系統(tǒng)損傷的分子機制并采取相應的干預措施尤為重要。長鏈非編碼RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)是兩類非編碼RNA,且lncRNA可靶向miRNA調控miRNA靶基因的表達,lncRNA/miRNA/靶基因這一調控途徑在神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要調控作用[3-4]。CRNDE是一種lncRNA,與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究顯示,CRNDE在低氧狀態(tài)下通過miR-181a/LYRM1軸調節(jié)心臟祖細胞的增殖和遷移,可為心肌梗死的治療提供分子靶點[5];CRNDE在膿毒癥大鼠肝組織和肝細胞中表達降低,上調其表達通過靶向抑制miR-126-5p并促進BCL2的表達減輕膿毒癥大鼠肝損傷[6]。但目前,CRNDE對缺血缺氧性腦損傷的影響和作用機制還未明確。StarBase生物在線軟件預測顯示,CRNDE可能靶向調控miR-212-5p。有研究[7]顯示,miR-212-5p在腦皮質損傷大鼠中表達下調,上調其表達可靶向抑制Ptgs2來抑制肥大細胞死亡,改善腦皮質損傷大鼠的學習和記憶功能。本研究通過體外原代培養(yǎng)大鼠皮質神經元,建立氧糖剝奪(OGD)誘導的神經元損傷模型,旨在觀察CRNDE能否靶向miR-212-5p影響OGD誘導的神經元損傷,以期為缺血缺氧性腦損傷的治療提供新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 雄性SD大鼠,清潔級,7日齡,體質量10.30 ～13.16 g,河南省實驗動物中心,許可證號:SYXK(豫)2019-0003;胎牛血清(FBS),浙江天杭生物科技股份有限公司;DMEM培養(yǎng)基和細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8),北京索萊寶科技有限公司;LipofectamineTM2000試劑盒和Trizol試劑,美國Invitrogen公司;逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒,深圳晶美生物工程有限公司;PCR引物、CRNDE小干擾RNA(si-CRNDE)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、CRNDE野生型質粒(WT-CRNDE)和突變型質粒(MUT-CRNDE)、miR-212-5p 模擬物(mimics)及對照序列(miR-NC)、miR-212-5p抑制劑(anti-miR-212-5p)及陰性對照序列(anti-miR-NC),上海生工生物工程有限公司;乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒,南京建成生物工程研究所;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒,上海碧云天生物技術有限公司;兔抗鼠B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bax)多克隆抗體,美國Santa Cruz公司;雙熒光素酶活性檢測試劑盒,美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉染 參照文獻[2]方法分離培養(yǎng)大鼠皮質神經元。SD大鼠脫頸椎處死取腦組織,分離大腦皮層,手術剪剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的小塊,0.25%胰蛋白酶37 ℃消化25 min,終止消化,過200目濾網,1 000 r/min離心5 min,棄上清液。加含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液,接種于0.01%多聚賴氨酸浸泡過夜的6孔培養(yǎng)板中,置于37 ℃、5% CO2、濕度97%培養(yǎng)箱(常規(guī)培養(yǎng)箱)中培養(yǎng)。培養(yǎng)6 h后,加含10% FBS、2% B27和1% L-谷氨酰胺的神經培養(yǎng)液培養(yǎng)。以后每3 d半量換液1次,培養(yǎng)至第7代時用于實驗。將神經元以每孔1×105個接種于6孔板中,采用LipofectamineTM2000脂質體法,分別轉染si-NC、si-CRNDE、miR-NC、miR-212-5p mimics、共轉染si-CRNDE與anti-miR-NC、si-CRNDE與anti-miR-212-5p。轉染時間為6 h,然后更換培養(yǎng)基,再培養(yǎng)24 h,收集細胞備用。

1.2.2 OGD誘導的神經元損傷模型建立 參照文獻[1]方法建立OGD誘導的神經元損傷模型。將神經元接種于培養(yǎng)板中,培養(yǎng)12 h后,棄培養(yǎng)基,換為無糖DMEM培養(yǎng)基,并置于37 ℃、5% CO2、95% N2、濕度97%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。

1.2.3 細胞分組處理 未轉染的神經元分為Con組和OGD組,其中Con組神經元用常規(guī)培養(yǎng)箱培養(yǎng),OGD組神經元按照1.2.2進行OGD處理。轉染si-NC、si-CRNDE、miR-NC、miR-212-5p mimics、共轉染si-CRNDE與anti-miR-NC、si-CRNDE與anti-miR-212-5p的神經元均按照1.2.2進行OGD處理,并分別記為OGD+si-NC組、OGD+si-CRNDE組、OGD+miR-NC組、OGD+miR-212-5p組、OGD+si-CRNDE+anti-miR-NC組和OGD+si-CRNDE+anti-miR-212-5p組。

1.2.4 RT-qPCR檢測CRNDE和miR-212-5p表達 神經元以2.5×104個/孔接種于24孔板中,按1.2.3分組處理,培養(yǎng)24 h后,收集神經元。Trizol試劑提取神經元中總RNA,然后逆轉錄為cDNA,最后行PCR擴增。擴增條件:95 ℃5 min,95 ℃10 s,60 ℃30 s,72 ℃30 s,共35個循環(huán)。引物序列:CRNDE上游5′-AAA TTC ATC CCA AGG CTG GT-3′,下游5′-AAA CCA CTC GAG CAC TTT GA-3′;GAPDH上游5′-CTG ACT TCA ACA GCG ACA CC-3′,下游5′-GTG GTC CAG GGG TCT TAC TC-3′;miR-212-5p上游5′-GTC CAG ATC GTA GGC GC-3′,下游5′-GTC GGC TCT TAG GAG AGC TC-3′;U6上游5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′,下游5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。2-△△Ct法計算CRNDE相對GAPDH、miR-212-5p相對U6的表達量。

1.2.5 CCK-8法檢測神經元存活率 神經元以1.0×104個/孔接種于96孔板中,按1.2.3分組處理,培養(yǎng)24 h后,加10 μL CCK-8試劑。孵育神經元2 h后,酶標儀450 nm處測吸光度值(A),并計算神經元存活率。存活率(%)=A實驗組/A對照組×100%。

1.2.6 試劑盒檢測培養(yǎng)上清液中LDH水平 神經元以2.5×104個/孔接種于24孔板中,按1.2.3分組處理,培養(yǎng)24 h后,收集培養(yǎng)上清液,3 500 r/min離心10 min,保留上清液。參照LDH試劑盒說明書,檢測上清中LDH活性,計算其漏出率。漏出率(%)=LDH活性實驗組/LDH活性對照組×100%。

1.2.7 流式細胞儀檢測神經元凋亡 神經元以2.5×104個/孔接種于24孔板中,按1.2.3分組處理,培養(yǎng)24 h后,收集神經元。PBS清洗神經元2次,參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書,用流式細胞儀檢測神經元凋亡。

1.2.8 Western blotting法檢測Bcl-2和Bax蛋白表達 神經元以2.5×104個/孔接種于24孔板中,按1.2.3分組處理,培養(yǎng)24 h后,收集神經元。RIPA試劑提取神經元中總蛋白,并用BCA法對蛋白定量。然后以每孔30 μg蛋白行SDS-PAGE電泳,并將分離蛋白濕轉至PVDF膜。于5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h后,分別置于Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)一抗孵育液中,4 ℃孵育過夜。再置于山羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育液中,37 ℃孵育1 h。最后加顯影液避光顯影,WD-9413C型凝膠成像系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司)曝光拍照。

1.2.9 雙熒光素酶報告基因實驗 將對數(shù)期的大鼠皮質神經元以每孔1×105個接種于6孔板中,采用LipofectamineTM2000脂質體法,分別共轉染WT-CRNDE與miR-NC或miR-212-5p mimics、MUT-CRNDE與miR-NC或miR-212-5p mimics。轉染時間為6 h,然后更換培養(yǎng)基,再培養(yǎng)24 h,收集細胞并裂解。然后參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明,檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用t(或t′)檢驗。

2 結果

2.1 CRNDE和miR-212-5p在OGD誘導的大鼠皮質神經元中的表達 與Con組比較,OGD組CRNDE水平升高(P<0.01),miR-212-5p水平降低(P<0.01)(見表1)。

表1 CRNDE和miR-212-5p在OGD誘導的大鼠皮質神經元中的表達

2.2 干擾CRNDE表達對OGD誘導的大鼠皮質神經元損傷的影響 與Con組比較,OGD組神經元存活率降低(P<0.01),LDH漏出率升高(P<0.05),神經元凋亡率升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表達降低(P<0.01),Bax蛋白表達升高(P<0.01)。與OGD+si-NC組比較,OGD+si-CRNDE組神經元存活率升高(P<0.01),LDH漏出率降低(P<0.01),神經元凋亡率降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表達升高(P<0.01),Bax蛋白表達降低(P<0.01)(見圖1、2及表2)。

表2 干擾CRNDE對OGD誘導的大鼠皮質神經元損傷的影響

2.3 過表達miR-212-5p對OGD誘導的大鼠皮質神經元損傷的影響 與OGD+miR-NC組比較,OGD+miR-212-5p組神經元存活率升高(P<0.01),LDH漏出率降低(P<0.01),神經元凋亡率降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表達升高(P<0.01),Bax蛋白表達降低(P<0.01)(見圖3、4及表3)。

表3 過表達miR-212-5p對OGD誘導的大鼠皮質神經元損傷的影響

2.4 敲減miR-212-5p逆轉干擾CRNDE表達對OGD誘導的大鼠皮質神經元損傷的影響 與OGD+si-CRNDE+anti-miR-NC組比較,OGD+si-CRNDE+anti-miR-212-5p組神經元存活率降低(P<0.01),LDH漏出率升高(P<0.01),神經元凋亡率升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表達降低(P<0.01),Bax蛋白表達升高(P<0.01)(見圖5、6及表4)。

表4 敲減miR-212-5p逆轉干擾CRNDE對OGD誘導的大鼠皮質神經元損傷的影響

2.5 CRNDE靶向負調控miR-212-5p表達 CRNDE與miR-212-5p的核苷酸序列見圖7。共轉染WT-CRNDE與miR-212-5p mimics的神經元熒光素酶活性低于共轉染WT-CRNDE與miR-NC的神經元(0.35±0.03 vs 0.98±0.04,t=37.80,P<0.01),而共轉染WT-CRNDE與miR-212-5p mimics的神經元熒光素酶活性與共轉染WT-CRNDE與miR-NC的神經元熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學意義(0.99±0.05 vs 1.00±0.04,t=0.47,P>0.05)。同時轉染si-CRNDE的神經元中miR-212-5p水平高于轉染si-NC的神經元(2.88±0.24 vs 1.03±0.07,t=22.20,P<0.01)。

3 討論

作為一種lncRNA,CRNDE參與多種疾病的發(fā)展進程。研究顯示,CRNDE在肝癌[8]、前列腺癌[9]和宮頸癌[10]等腫瘤中的表達明顯增加,促進腫瘤的發(fā)展進程。YANG等[11]研究顯示,CRNDE在硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導的結腸炎小鼠結腸組織和結腸上皮細胞系HT-29、LOVO和Caco-2中均表達升高,干擾其表達可靶向上調miR-495并下調SOCS1抑制了DSS誘導的結腸上皮細胞凋亡,其可能是炎性腸病的新治療靶標。SUN等[12]研究顯示,敲減CRNDE可通過阻斷TLR3 /NF-κB途徑降低敗血癥誘導的急性腎損傷,CRNDE有望成為敗血癥相關急性腎損傷的臨床治療靶標。但目前,CRNDE對氧糖剝奪誘導的神經元損傷的影響和機制還未知。

LDH是一種糖酵解酶,主要存在于細胞質中。當細胞受損時,細胞膜通透性增加,LDH立即釋放至細胞外。因此,細胞培養(yǎng)基中LDH活性的高低是反映細胞受損程度的靈敏性指標[13]。本研究顯示,大鼠皮質神經元經氧糖剝奪處理后,細胞活性降低,凋亡加劇,LDH漏出率顯著升高,與張璟璇等[14]報道的結果一致,表明氧糖剝奪致大鼠皮質神經元損傷模型建立成功。本研究顯示,氧糖剝奪促進了大鼠皮質神經元中CRNDE的表達,而干擾CRNDE表達促進了氧糖剝奪誘導的大鼠皮質神經元增殖,且抑制了神經元凋亡及LDH漏出率,說明干擾CRNDE表達減輕了氧糖剝奪誘導的大鼠皮質神經元損傷。細胞凋亡是一種受多種基因調控的程序性死亡過程。Bcl-2和Bax參與調控細胞凋亡,抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加抑制細胞凋亡,而促凋亡蛋白表達增加則促進細胞凋亡[15-16]。本研究顯示,干擾CRNDE表達抑制了氧糖剝奪誘導的大鼠皮質神經元中Bax蛋白的表達,而促進了Bcl-2蛋白的表達,進一步說明干擾CRNDE表達抑制了氧糖剝奪誘導的大鼠皮質神經元凋亡,減輕了氧糖剝奪誘導的大鼠皮質神經元損傷。

miR-212-5p基因定位于人17號染色體,與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。例如,miR-212-5p靶向抑制c-Myc表達降低TGF-β1和Ang Ⅱ誘導的心臟成纖維細胞增殖及膠原形成,改善心肌梗死小鼠的心臟功能[17]。miR-212-5p可靶向抑制SIRT2減少多巴胺能神經元丟失和DAT降低,減輕神經損傷,miR-212-5p/SIRT2軸為帕金森病的治療提供了新靶點[18]。本研究顯示,過表達miR-212-5p增強了氧糖剝奪誘導的大鼠皮質神經元增殖活性,且抑制了神經元凋亡,降低了細胞LDH漏出率,表明過表達miR-212-5p減輕了氧糖剝奪誘導的大鼠皮質神經元損傷。lncRNA可發(fā)揮miRNA分子海綿作用影響miRNA靶基因的表達,進而發(fā)揮生物學調控作用[19]。為了研究CRNDE影響氧糖剝奪誘導的大鼠皮質神經元損傷的分子機制,本研究首先利用雙熒光素酶報告基因實驗及檢測干擾CRNDE對miR-212-5p表達的影響,證實了CRNDE在大鼠皮質神經元中靶向負調控miR-212-5p表達,這與氧糖剝奪促進了大鼠皮質神經元中CRNDE的表達,而降低了miR-212-5p表達的結果一致;此外,敲減miR-212-5p逆轉了干擾CRNDE對氧糖剝奪誘導的大鼠皮質神經元增殖、凋亡及LDH漏出率的影響,提示CRNDE通過靶向負調控miR-212-5p來影響氧糖剝奪誘導的大鼠皮質神經元損傷,但是CRNDE具體調控的miR-212-5p的靶基因還有待進一步探究。

綜上,氧糖剝奪處理的大鼠皮質神經元中CRNDE表達升高,干擾CRNDE表達促進了氧糖剝奪誘導的大鼠皮質神經元增殖,并抑制了神經元凋亡及LDH漏出率,減輕了神經元損傷,這可能與CRNDE靶向負調控miR-212-5p有關,CRNDE/miR-212-5p軸可能為缺血缺氧性腦損傷的治療提供了新的分子靶點。但本研究尚未對miR-212-5p的靶基因進行探究,尚需更深一步探究CRNDE作用的miR-212-5p的靶基因在氧糖剝奪處理的大鼠皮質神經元損傷中的作用;同時,本研究僅利用體外細胞實驗進行了探究,還需進一步建立動物模型,在體內觀察CRNDE/miR-212-5p/靶基因這一信號通路對大鼠皮質神經元損傷的影響。