李洪雷,王丹晨,馬超超,徐二木,侯立安,夏良裕(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京100730)

線性范圍(linear range)指使實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的最終分析結(jié)果為可接受的線性濃度范圍,此時(shí)非線性誤差應(yīng)低于允許誤差[1]。臨床實(shí)驗(yàn)室常采用平均斜率法[2]、線性稀釋回收法[2-3]、美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)的EP06-A指南[4]確定檢測(cè)項(xiàng)目的線性。2020年11月CLSI對(duì)EP06-A進(jìn)行修訂,頒布了EP06-Ed2[5]替代EP06-A,該版本推薦采用加權(quán)最小二乘法擬合預(yù)測(cè)值和檢測(cè)值之間的線性,而不再采用擬合多項(xiàng)式進(jìn)行線性驗(yàn)證。本研究以尿總蛋白定量分析項(xiàng)目為代表研究對(duì)象,將EP06-Ed2方法與EP06-A、平均斜率法、線性稀釋驗(yàn)證法進(jìn)行比較,為臨床實(shí)驗(yàn)室選擇線性范圍確認(rèn)方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集臨床檢測(cè)剩余尿液樣品用于本研究。收集尿總蛋白濃度超過(guò)試劑說(shuō)明書檢測(cè)上限高值樣品(H)和尿總蛋白濃度接近檢測(cè)下限的低值樣品(L)。

1.2儀器與試劑 Beckman AU2700自動(dòng)生化分析儀。尿總蛋白試劑盒(RANDOX公司,批號(hào):408949)。檢測(cè)原理為焦酚紅比色法。按照制造商提供的說(shuō)明書設(shè)置參數(shù),完成校準(zhǔn)和質(zhì)控,在實(shí)驗(yàn)開始前檢測(cè)質(zhì)控物,結(jié)果合格后開始實(shí)驗(yàn)。

1.3樣品制備

1.3.1線性初步評(píng)價(jià)樣品 選擇34 mg/L低濃度樣品(L)和5 510 mg/L高濃度樣品(H),按照體積比為10L、9L∶1H、8L∶2H、7L∶3H、6L∶4H、5L∶5H、4L∶6H、3L∶7H、2L∶8H、1L∶9H、10H制備11份樣品。從低到高各檢測(cè)3次,記錄結(jié)果。

1.3.2線性確定實(shí)驗(yàn)樣品 根據(jù)線性初步評(píng)價(jià)結(jié)果去掉明顯偏離直線的數(shù)據(jù)點(diǎn)后選擇臨床樣品中已測(cè)濃度為9 mg/L的低濃度樣品(L)和3 222 mg/L的高濃度樣品(H),按10L、9L∶1H、8L∶2H、7L∶3H、6L∶4H、5L∶5H、4L∶6H、3L∶7H、2L∶8H、1L∶9H、10H的比例制備11份樣品。

1.4線性范圍驗(yàn)證方法 分別采用EP06-Ed2、EP06-A、平均斜率法及線性稀釋回收法確定尿總蛋白的線性范圍。

1.4.1EP06-Ed2法確定線性 采用高、低濃度的樣品混合制備線性評(píng)估樣品,保證混合后的濃度在線性范圍內(nèi);線性范圍內(nèi)的每個(gè)樣品檢測(cè)3次取平均值;采用散點(diǎn)圖剔除離群值;每個(gè)濃度樣品檢測(cè)的平均濃度與預(yù)期濃度確定最佳的擬合直線回歸方程;每個(gè)濃度樣品的平均值與最佳擬合直線的擬合值的偏差均在線性允許偏差(allowable deviation from linearity,ADL)范圍內(nèi),則證明該線性可接受。

1.4.2EP06-A法確定線性 以樣品號(hào)為X,實(shí)測(cè)值的均值為Y,繪制散點(diǎn)圖。初步檢查數(shù)據(jù),剔除離群值,判斷重復(fù)性,進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析,并繪制散點(diǎn)圖進(jìn)行評(píng)價(jià)。測(cè)量數(shù)據(jù)擬合為一次多項(xiàng)式(Y=b0+b1X)、二次多項(xiàng)式(Y=b0+b1X+b2X2)、三次多項(xiàng)式(Y=b0+b1X+b2X2+b3X3)。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算每個(gè)非線性系數(shù)斜率的標(biāo)準(zhǔn)誤SEi,然后采用t檢驗(yàn),判斷非線性系數(shù)與0差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即P<0.05代表非線性系數(shù)與0差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最終求得臨床可接受的最佳擬合多項(xiàng)式。

1.4.3平均斜率法確定線性

1.4.3.1線性初步評(píng)價(jià) 參考CLSI EP06-A[4]方案,將11份樣品按濃度由低到高依次編號(hào),每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。以樣品號(hào)為橫坐標(biāo)(X),該樣品號(hào)對(duì)應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果的均值為縱坐標(biāo)(Y),繪制散點(diǎn)圖,根據(jù)分布情況目測(cè)離群值,初步判定檢測(cè)上限。

1.4.3.2平均斜率法確定線性 線性確認(rèn)樣品各重復(fù)測(cè)量3次,記錄結(jié)果。以預(yù)期值為X,實(shí)測(cè)值的均值為Y繪制散點(diǎn)圖,計(jì)算直線回歸方程Y=a+bX、相關(guān)系數(shù)(r)及回歸決定系數(shù)(R2)。若R2>0.995,斜率(b)的95%可信區(qū)間包含1,截距(a)的95%可信區(qū)間包含0,即可確定呈線性,若上述任何一項(xiàng)不滿足條件,則去掉最高點(diǎn)數(shù)據(jù)重新確定。

1.4.4線性稀釋回收法 根據(jù)高、低樣品配制的比例關(guān)系,計(jì)算每個(gè)樣品的理論值,將試劑檢測(cè)結(jié)果作為實(shí)測(cè)值,以理論值作為X,實(shí)測(cè)值作為Y,進(jìn)行直線回歸分析,若R2≥0.975,b的95%可信區(qū)間包含1(b與1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),a的95%可信區(qū)間包含0(a與0差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),則可判斷為線性,然后計(jì)算稀釋回收率,可接受范圍為90%～110%,則可確定實(shí)驗(yàn)所選的濃度即為線性范圍。若上述任何一項(xiàng)不滿足條件,則去掉最高點(diǎn)數(shù)據(jù)重新確定。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用Excel2016和MedCalc15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1線性初步評(píng)價(jià)結(jié)果 線性評(píng)價(jià)散點(diǎn)圖見(jiàn)圖1。目測(cè)從第6個(gè)樣品(實(shí)測(cè)濃度為3 308 mg/L)開始,測(cè)量結(jié)果偏低,初步判斷線性上限在3 300 mg/L。

圖1 線性初步評(píng)價(jià)散點(diǎn)圖

2.2EP06-Ed2法確定線性[5]目測(cè)法觀察離群值:尿總蛋白重復(fù)檢測(cè)濃度及相對(duì)濃度(relative concentrations,RCs)散點(diǎn)圖顯示所有重復(fù)檢測(cè)結(jié)果均包括在線性范圍內(nèi),故不需要剔除離群值。不精密度驗(yàn)證:每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次,重復(fù)性以CV表示,為0.3%～6.2%。采用加權(quán)最小二乘法(weighted least squares regression,WLS)計(jì)算線性。自變量(X)為期望值,因變量(Y)為檢測(cè)值,WLS權(quán)重為R/Var(R為重復(fù)檢測(cè)次數(shù),Var為方差),方程為Y=1.025X+0.72,R2為0.999。尿總蛋白線性范圍計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。ADL均在±10%以內(nèi)。最終確定線性范圍為9～3 222 mg/L。

表1 尿總蛋白線性范圍計(jì)算結(jié)果

2.3EP06-A法確定線性 一次多項(xiàng)式、二次多項(xiàng)式、三次多項(xiàng)式結(jié)果及擬合曲線見(jiàn)表2。EP06-A方法評(píng)價(jià)二次、三次多項(xiàng)式與直線回歸的偏差結(jié)果見(jiàn)表3。二次多項(xiàng)式與一次多項(xiàng)式的百分偏差為-103.2%～2.4%,三次多項(xiàng)式與一次多項(xiàng)式的百分偏差為-70.3%～0.4%。二次多項(xiàng)式、三次多項(xiàng)式與一次多項(xiàng)式的差值顯示均為低濃度偏差較大,最終確定線性范圍為331～3 222 mg/L。

表2 尿總蛋白EP06-A評(píng)價(jià)多項(xiàng)式擬合結(jié)果

表3 EP06-A方法評(píng)價(jià)二次、三次多項(xiàng)式與直線回歸的偏差(11個(gè)點(diǎn))

2.4平均斜率法確定線性 線性初步評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,回歸方程為Y=35.4+1.0X,R2為0.999,r為0.999 6(95%CI:0.998 4～0.999 9),a為35.4(95%CI:-6.2～76.9),b為1.0(95%CI:0.99～1.03)。確定線性范圍為9～3 222 mg/L。

2.5線性稀釋回收法 9～3 222 mg/L之間的11份樣品的檢測(cè)結(jié)果同平均斜率法?；貧w方程為Y=35.4+1.0X,R2為0.999,r為0.999 6(95%CI:0.998 4～0.999 9),a為35.4(95%CI:-6.2～76.9),b為1.0(95%CI:0.99～1.03),確定為線性。每個(gè)濃度樣品的稀釋回收率結(jié)果見(jiàn)表4,回收率在100%～106.4%,稀釋偏差在0%～6.4%,最終確定線性范圍為9～3 222 mg/L。

表4 線性稀釋回收法確定線性范圍的每個(gè)濃度樣品稀釋回收率結(jié)果

3 討論

非配套檢測(cè)系統(tǒng),即由實(shí)驗(yàn)室選擇不同廠商生產(chǎn)的分析儀器和試劑組合而成的自建檢測(cè)系統(tǒng),在國(guó)內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用較多。ISO 15189要求對(duì)自建檢測(cè)系統(tǒng)性能進(jìn)行確認(rèn),證明其性能滿足臨床要求后方可應(yīng)用于臨床檢測(cè)工作中[6]。線性范圍是反映檢測(cè)系統(tǒng)性能的一項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo),其確認(rèn)方法有多種,常用的有EP06-A、平均斜率法、線性稀釋回收法[7]。2020年CLSI以EP06-Ed2替代EP06-A,國(guó)內(nèi)對(duì)該方法與評(píng)價(jià)較少,本研究對(duì)上述4種方法進(jìn)行比較研究,可為臨床實(shí)驗(yàn)室選擇線性范圍確認(rèn)方法提供參考。

線性范圍確認(rèn)過(guò)程的第一步為目測(cè)法初步評(píng)價(jià),通過(guò)研究可發(fā)現(xiàn)該方法比較簡(jiǎn)單,容易識(shí)別非線性數(shù)據(jù)點(diǎn),是確定后續(xù)研究高濃度水平樣品選擇的依據(jù)。

本研究采用EP06-Ed2、平均斜率法、線性稀釋回收法確定的尿總蛋白的線性范圍均為9～3 222 mg/L,而EP06-A法確定的線性范圍為331～3 222 mg/L。EP06-A法的線性范圍下限明顯高于另外3種方法,存在很大的偏差,這是該方法的重大缺陷。由本研究可見(jiàn),新發(fā)布的EP06-Ed2已經(jīng)對(duì)此進(jìn)行修正,采用最小加權(quán)二乘法和臨床可接受性偏差分析方法避免這個(gè)問(wèn)題。EP06-A統(tǒng)計(jì)過(guò)程中要進(jìn)行數(shù)個(gè)多項(xiàng)式的回歸分析及數(shù)據(jù)擬合分析,對(duì)于臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)工作人員而言,統(tǒng)計(jì)過(guò)程太過(guò)復(fù)雜,不易掌握。采用最小加權(quán)二乘法取代了EP06-A的多項(xiàng)式回歸方法,簡(jiǎn)化了方法的同時(shí)也提供了一種相對(duì)簡(jiǎn)單的分析方法,更便于臨床實(shí)驗(yàn)室工作人員的掌握與應(yīng)用。相對(duì)于EP06-A和EP06-Ed2,平均斜率法、線性稀釋回收法操作簡(jiǎn)單,不需要復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)過(guò)程,結(jié)果滿足常規(guī)工作需求,適于臨床實(shí)驗(yàn)室選擇采用。