蔣義,陽智芬,曹麗群,陳潔,楊妞,康甜,謝毓濱(長沙血液中心輸血研究所,長沙410001)

單采血小板輸注主要用于預(yù)防和治療血小板減少或血小板功能異常引起的出血,然而免疫性血小板無效輸注(platelet transfusion refractoriness,PTR)在長期血小板輸注的患者中發(fā)生率為10%～70%,遠高于其他輸血不良反應(yīng)的發(fā)生率[1]。免疫性PTR主要由人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)抗體及人類血小板抗原(human platelet antigen,HPA)抗體引起,而HLA及HPA抗原具有遺傳多態(tài)性,在不同地區(qū)和不同人群中分布有所差異[2]。因此,建立本地區(qū)血小板供者已知HLA/HPA基因數(shù)據(jù)庫,可為臨床提供與患者HLA/HPA相匹配的單采血小板,大大降低免疫性PTR的發(fā)生,提高臨床血小板輸注的有效性。目前,長沙地區(qū)已建立了血小板供者已知HLA/HPA基因數(shù)據(jù)庫,但建立多大的庫存規(guī)模可滿足本地區(qū)臨床基因匹配單采血小板的供應(yīng)尚在摸索實踐中,本研究通過對已知數(shù)據(jù)進行分析,探討建設(shè)規(guī)模與匹配程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1研究對象 長沙地區(qū)無親緣關(guān)系的單采血小板捐獻者1 029名,年齡18～45歲,所有志愿者均簽署加入血小板資料庫知情同意書。本研究已通過長沙血液中心倫理委員會批準。

1.2主要儀器與試劑 Ion Gene StudioTMS5二代測序儀,A24811 PCR儀、Q5熒光定量PCR儀及AllTypeTMNGS HLA分型試劑(美國賽默飛世爾科技公司),Epoch酶標儀(美國BioTek公司)。全血基因組DNA提取試劑盒(北京天根公司),熒光PCR法HPA基因分型試劑盒(江蘇偉禾公司)。

1.3方法

1.3.1DNA提取 按照試劑盒說明書提取外周血DNA,其濃度≥30 ng/μL,A260 nm/A280 nm值1.6～2.0。

1.3.2HPA基因分型 采用多重?zé)晒釶CR法,按照試劑說明書進行HPA-1～6、10、15及21的基因分型,針對HPA系統(tǒng)多態(tài)性位點設(shè)計擴增引物和熒光探針,利用Taq酶5′端外切的特性,分離探針上的淬滅熒光基團和報告熒光基團,依據(jù)熒光強度直接分析產(chǎn)物情況。使用配套軟件(WeHelpReportV1.0.0.26),內(nèi)標無異常,擴增曲線呈典型S型且CT值<35判斷HPA基因相應(yīng)亞型陽性。

1.3.3HLA基因分型 采用二代測序法,按照標準流程進行HLA基因測序,測序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)使用配套TSV軟件分析基因型。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用SHESIS軟件進行Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)檢驗,HLA-A、B位點及HPA等位基因觀察頻率及理論頻率之間的比較采用χ2檢驗,檢驗水準設(shè)為0.05。

采用直接計算法計算HLA-A、B位點及HPA等位基因頻率(allele frequency,AF):AF=(aa+ab/2)/總?cè)藬?shù),a、b等位基因。基因型頻率(genotype frequency,GF):GF=陽性數(shù)(aa或ab或bb)/總?cè)藬?shù),采用MATLAB軟件評估血小板庫HLA、HPA表型匹配概率及最小庫容:如果用fi表示第i種表型的頻率,在由n個供者組成的血小板庫中,任何患者都能找到至少1例HLA表型或HPA表型相同供者的概率為P,P=∑fi×[1-(1-fi)n],i代表所有可能的表型[3]。P值與血小板庫中的供者數(shù)N以及表型頻率相關(guān),如果以N為橫坐標,以計算求得的P值為縱坐標,可得到一條P值隨N變化的曲線,通過對數(shù)轉(zhuǎn)化可導(dǎo)出表型匹配概率曲線的回歸方程式,計算得到一定供者數(shù)情況下找到≥1例HLA表型匹配供者的概率及最小庫容。

計算CREG(cross-reactive groups,交叉反應(yīng)組)各組頻率及不配合率:根據(jù)CREG血清學(xué)特點,將HLA-A、B抗原分成9個組(1C、2C、4C、5C、6C、7C、8C、10C和12C)[4],CREG基因頻率為其對應(yīng)的HLA-A、B抗原頻率之和,CREG不配合概率(Punmatch,Pu),Pu=2xy(1-xy),x和y為CREG基因頻率。

2 結(jié)果

2.1Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗 1 029名血小板基因數(shù)據(jù)庫捐獻者的HLA-A、B位點,HPA基因型的觀察頻率與理論頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(HLA-A:χ2=32.329,P=0.18;HLA-B:χ2=40.563,P=0.35;HPA:χ2=26.563,P=0.12,Pc>0.05),該研究對象HLA-A、B,HPA等位基因的分布均符合Hardy-Weinberg平衡。

2.2長沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫HLA等位基因多態(tài)性 1 029名血小板捐獻者中,檢出HLA-A等位基因34個(見表1),其中頻率大于1%的13個,最高的依次為A*11:01、A*24:02、A*02:07、A*02:01、A*33:03,累計頻率占A位點的75.02%;檢出HLA-B等位基因75個(見表2),其中頻率大于1%的19個,最高的依次為B*40:01、B*46:01、B*13:01、B*58:01、B*15:02,累計頻率占B位點的51.11%;根據(jù)等位基因分布推出對應(yīng)抗原分布情況,見表3。檢出HLA抗原表型619種,其中頻率大于1%的6種,分別為A2-A11-B60-B46(2.33%)、A2-A2-B46-B46(1.46%)、A2-A11-B75-B46(1.46%)、A2-A33-B46-B58(1.36%)、A2-A24-B60-B46(1.07%)、A11-A11-B13-B60(1.07%)。

表2 HLA-B等位基因分布

表3 長沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫HLA-A、B位點抗原分布

2.3長沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫HPA等位基因多態(tài)性 1 029名血小板基因數(shù)據(jù)庫捐獻者HPA 1～6、10、15、21中,HPA-3和HPA-15雜合度較高,HPA 2a頻率為95.72%,HPA-1a、HPA-4a、HPA-5a、HPA-6a、HPA-10a、HPA-21a頻率均高于98%,未檢出HPA-10b,HPA基因型及等位基因頻率見表4。共檢出59種HPA表型,其中頻率大于1%的13種,最常見的表型為HPA 1aa-2aa-3ab-4aa-5aa-6aa-10aa-15ab-21aa(20.89%),其次為HPA 1aa-2aa-3aa-4aa-5aa-6aa-10aa-15ab-21aa(15.45%)和HPA 1aa-2aa-3ab-4aa-5aa-6aa-10aa-15aa-21aa(10.79%)。

表4 長沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫HPA基因型分布

2.4長沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫HLA、HPA表型匹配概率 HLA和HPA表型匹配概率(P)與庫容(N)的關(guān)系見表5,當庫容為1 065人,80%的患者可以在長沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫找到至少1名HLA-A、B位點表型一致的供者;當庫容為2 127人,匹配概率為95%;目前庫容為1 029人,匹配概率為79.25%。當庫容為207人的時候,95%的患者在長沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫找到至少1名HPA表型一致的供者。血小板基因數(shù)據(jù)庫人數(shù)與HLA及HPA表型匹配概率擬合曲線圖見圖1。

圖1 血小板基因數(shù)據(jù)庫人數(shù)與HLA及HPA表型匹配概率曲線

表5 HLA和HPA表型匹配概率(P)與庫容(N)的關(guān)系

2.5長沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫CREGs不配合率 長沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫CREGs頻率見表6,HLA-A抗原CREG表位發(fā)生的1C與2C不配合的概率(44.31%)最高;1C與10C、2C與10不配合率分別為38.24%、36.20%。HLA-B抗原CREG表位發(fā)生的7C與5C不配合的概率(33.12%)最高;5C與12C、7C與12C不配合率分別為26.24%、24.25%。Broad CREG中4C與6C的不配合概率為42.24%;4C與8C、8C與10C不配合率分別為6.61%、10.01%。

表6 長沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫CREGs頻率

3 討論

估計HLA-Ⅰ匹配供者的血小板捐獻者庫的大小,通常需要準確計算HLA表型頻率,了解人群中HLA表型的分布情況[5-6]。長沙地區(qū)HLA A/B抗原表型相對集中,13種HLA-A頻率大于0.01,累計頻率75.02%,19種HLA-B頻率大于0.01,累計頻率的51.11%。本研究中統(tǒng)計的HLA等位基因多態(tài)性、高頻表型與文獻中長沙地區(qū)HLA等位基因多態(tài)性及表型報道接近[7],結(jié)合Hardy-Weinberg平衡結(jié)果可知長沙地區(qū)獻血人群群體遺傳穩(wěn)定,更利于后續(xù)建庫尋找相合供者。

HPA系統(tǒng)中對偶抗原不配合的比例越高,產(chǎn)生HPA抗體的機會越多,造成PTR的可能性越大[8-9]。作為供者,患者產(chǎn)生HPA同種免疫性抗體后,有效的供者應(yīng)與患者具有相同的HPA-aa或bb純合子基因型。本研究結(jié)果可見,長沙地區(qū)除HPA-3、15雜合較高外,其余98%以a基因為主,說明長沙地區(qū)人群HPA系統(tǒng)組合分布相對集中,找到上述HPA系統(tǒng)相符供者基因庫容也相對較小。

計算長沙地區(qū)單采血小板捐獻者HLA-A、B等位基因頻率,表型頻率并推導(dǎo)出最大限度滿足等待血小板輸注患者需求庫容。根據(jù)本研究實驗數(shù)據(jù),在不考慮ABO血型的情況下,理論預(yù)測長沙地區(qū)血小板供者資料庫庫容為1 029人,約有79.25%的患者能在該庫中找到≥1名HLA-A、-B表型匹配的供者。當庫容為207人的時候,95%的患者在長沙地區(qū)血小板基因數(shù)據(jù)庫找到至少1名HPA表型一致的供者。

精準匹配與輸注對臨床應(yīng)用而言卻更加縮小了供體選擇范圍,針對患者存在抗HLA的情形,可利用不完全相合供、受體即交叉反應(yīng)組CREG抗原相合、HLA-Matchmaker表位匹配法等[10]。故了解本地區(qū)單采血小板捐獻者CREGs基因頻率及表位不配合率對供者的選擇和減少因CREG抗原免疫產(chǎn)生CREG抗體所導(dǎo)致的PTR具有重要意義[11]。本研究中發(fā)現(xiàn)HLA-A抗原CREG表位的1C與2C、HLA-B抗原CREG表位的7C與5C,Broad CREG的4C與6C的不配合概率均較高,在臨床血小板輸注時選擇供者應(yīng)予以關(guān)注。

抗原已知型血小板供者庫的建立可為各類免疫性血小板減少患者快速找抗原相配合血小板供者[12-13]。在未能找到抗原陰性相合患者時,可結(jié)合CREG特異性分析。理論上庫容越大,找到供者的可能性就越大,但也需考慮建庫成本和效益,當庫容量達到一定大小時,增加供者獲得的效益將降低[14]。實際工作中,因選擇的獻血者在需要的規(guī)定時間內(nèi)無法捐獻[1],比如仍在獻血間隔期,暫時無合適時間、失去聯(lián)系等;另外ABO血型匹配、臨床患者對血小板制品的需求時間緊迫,無法等候配合血小板各流程所需時間,因此配合需要考慮患者有多次需求和供者的及時性問題,國外學(xué)者有建議理論庫容選擇至少有5個以上完全兼容供者[15]。因此,我們在后續(xù)血小板配型的臨床應(yīng)用時,結(jié)合ABO血型匹配性,在擴大有效庫容的同時將進一步驗證理論建模的適用性和匹配概率的符合性。