張蕾,黎杏蘋,李博紅,尹珊珊,馮晴,吳維青(南方醫(yī)科大學附屬深圳婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心,廣東深圳 518017)

血紅蛋白病是一組常見的遺傳性血液病,其中珠蛋白鏈分子結構異常者為異常血紅蛋白病,珠蛋白鏈合成量減少者為地中海貧血(簡稱“地貧”)。目前廣泛實施的地貧防控措施是根據(jù)血常規(guī)和血紅蛋白組分表型的篩查結果[1],通過DNA檢測進行基因分型確診,從而對夫婦雙方均為同型地貧基因攜帶的高風險胎兒進行產前基因診斷,防止重型地貧患兒的出生。

異常血紅蛋白Q-Thailand(HbQ-Thailand)是中國南方地區(qū)常見的異常血紅蛋白之一[2],1958年由Vella等[3]在1個中國人家庭中發(fā)現(xiàn)并報道[4-5]。HbQ-Thailand是由于HBA1基因第74密碼子上發(fā)生GAC>CAC(HBA1: c.223G>C)突變,導致所編碼的天門冬氨酸變成谷氨酸,血紅蛋白毛細管電泳檢測有其特異圖譜,表現(xiàn)為Z7區(qū)出現(xiàn)高比例的可疑HbQ-Thailand帶、在Z1區(qū)出現(xiàn)HbQA2帶。研究顯示,HbQ-Thailand常與α-地貧-α4.2缺失連鎖遺傳[6]。β-地貧基因以點突變?yōu)橹?亦包含HBB基因大片段缺失[7]。缺失型β-地貧的血液學表型表現(xiàn)為小細胞低色素性貧血,并以HbF明顯增高為顯著特征,而血紅蛋白毛細管電泳檢測的HbF也位于Z7區(qū),與HbQ-Thailand帶重疊。本研究報道2個HbQ-Thailand雜合子中檢出缺失型β-地貧基因的病例,分析總結其血液學參數(shù)表型特征,為此類復雜血紅蛋白病的實驗室檢測、臨床診斷和遺傳咨詢提供參考。

1 資料與方法

1.1研究對象 來我院進行地貧篩查者2例:患者1,女性,30歲,就診日期2019年10月10日;患者2,女性,27歲,就診日期2019年2月13日。2例患者的血常規(guī)檢測結果均表現(xiàn)為輕度小細胞低色素性貧血,毛細管血紅蛋白電泳結果均于Z7區(qū)出現(xiàn)高比例的可疑HbQ-Thailand帶、在Z1區(qū)出現(xiàn)HbQA2帶,即呈現(xiàn)HbQ-Thailand特征圖譜。2位研究對象均簽署知情同意書。

1.2標本采集與處理 采集患者靜脈血2管(EDTA-K3抗凝,每管2 mL),一管用于血常規(guī)及血紅蛋白電泳檢測,另一管4 ℃保存用于基因檢測。

1.3血液學分析 用XS-800i全血細胞分析儀(日本Sysmex公司)及配套試劑進行血常規(guī)檢測,以獲取紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(hemoglobin, Hb)、紅細胞平均體積(mean corpuscular volume,MCV)、平均紅細胞血紅蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin,MCH)等血液學表型參數(shù)。用SebiaCapillarys 2全自動毛細管血紅蛋白電泳儀(法國Sebia公司)及配套試劑進行血紅蛋白組分分析。

1.4常見地貧基因突變檢測 用Lab-Aid824核酸提取儀及配套試劑(廈門致善公司)從抗凝全血中提取基因組DNA(gDNA)。采用缺失型α、非缺失型α和β點突變地貧基因檢測試劑盒(深圳亞能生物公司)檢測中國人群常見的3種缺失型α-地貧基因(--SEA/、-α4.2/、-α3.7/),3種α非缺失型α-地貧基因(αCSα/、αWSα/、αQSα/),17種β-地貧基因(HBB:c.126_129delCTTT、c.52A>T、c.130G>T、c.216 _217insT、c.92+1G>T、c.92+ 5G>C、c.316-197C>T、c.-78A>C、c.-79A>G、c.-80T>C、c.-82C>A、c.-11_-8delAAAC、c.2T>G、c.45_46insG、c.84_85insC、c.79G>A、c.94delC)。

1.5Sanger測序 HbQ-Thailand是由于α1珠蛋白基因發(fā)生點突變。據(jù)此,特異性擴增HBA1基因序列并進行Sanger測序分析。擴增及測序的上游引物(F)為5′-GGAGGGTGGAGACGTCCTG-3′,下游引物(R)為5′-CAAAGACCACGGGGGTACG-3′。將測序結果與HBA1基因參考序列進行對比分析,以確定突變堿基及突變位置。

1.6跨越斷裂點聚合酶鏈反應(Gap-PCR)檢測β珠蛋白基因缺失 采用缺失型β-地貧基因檢測試劑盒(Gap-PCR法,深圳亞能生物公司),按操作說明檢測Gγ+(Aγδβ)0型、Taiwanese型及SEA-HPFH型β-地貧基因缺失。

2 結果

2.1血液學表型結果 如表1和圖1所示,2例患者均表現(xiàn)為MCV和MCH降低的小細胞低色素表型特征;血紅蛋白毛細管電泳結果顯示Z7區(qū)條帶(Hb或Hb Variants)明顯增高,且于Z1區(qū)出現(xiàn)異常帶。此血紅蛋白特異性圖譜提示很可能為HbQ-Thailand變異體,須進一步基因檢測確認。

注:A為患者1;B為患者2;均出現(xiàn)Z7區(qū)(HbF或Hb Variant)明顯增高,且于Z1區(qū)檢出變異體。C為正常樣本;D為β-地貧基因缺失雜合子樣本。

表1 2例患者血液學表型結果

2.2常見地貧基因突變檢測結果 經地貧基因檢測常規(guī)試劑盒,2例患者均只檢出α-地貧基因-α4.2缺失。按表型與基因型一致的診斷原則,此病例的基因型結果與其表型特征不符,提示需進一步檢測其他少見或罕見珠蛋白基因突變以明確診斷。

2.3Sanger測序檢測結果 血紅蛋白毛細管電泳結果提示為異常血紅蛋白HbQ-Thailand特征性圖譜,經α1珠蛋白基因測序,2例患者均驗證為HBA1:c.223G>C(p.74 Asp>His)的HbQ-Thailand異常血紅蛋白變異雜合子。測序結果見圖2。

2.4β-地貧基因缺失突變檢測結果 缺失型β-地貧基因檢測試劑盒(Gap-PCR法)的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果顯示:患者1為β-地貧基因Taiwanese缺失雜合,患者2為β-地貧基因Gγ+(Aγδβ)0缺失雜合。此基因型結果與Z7區(qū)HbF明顯增加的表型特征相符。見圖3。

注:190 bp為內參條帶,250 bp為正常條帶,330 bp是Gγ+(Aγδβ)0型缺失突變條帶,420 bp是SEA-HPFH型缺失突變條帶,670 bp是Taiwanese型缺失突變條帶。1,DL 2000 DNA Marker;2,Gγ+(Aγδβ)0缺失雜合陽性質控;3,SEA-HPFH缺失雜合陽性質控;4,Taiwanese型缺失雜合質控;5,正常樣本;6,患者1樣本(Taiwanese型缺失雜合);7,患者2樣本[Gγ+(Aγδβ)0型缺失雜合]。

2.5患者樣本確定基因型 綜合以上DNA分析檢測結果,患者1的基因型為異常血紅蛋白HbQ-Thailand雜合,合并α-地貧-α4.2缺失雜合和β-地貧Taiwanese型缺失雜合(αα/-α4.2,βTaiwanese/βN);患者2為HbQ-Thailand雜合,合并α-地貧-α4.2缺失雜合和β-地貧Gγ+(Aγδβ)0型缺失雜合(αα/-α4.2,βGγ+(Aγδβ)0/βN)。

3 討論

目前廣泛實施的地貧分子篩查通用方案是通過血常規(guī)和血紅蛋白組分進行表型分析,對表型篩查陽性者進行基因分型而明確診斷。除小部分靜止型外,地貧基因攜帶者的紅細胞參數(shù)表現(xiàn)為MCV<80 fL和/或MCH<27 pg的小細胞低色素的表型特征[7-8]。血紅蛋白組分分析的HbA2>3.5%和HbF>2%特征常提示為β-地貧基因攜帶。另外,血紅蛋白組分分析中出現(xiàn)其他異常條帶即提示異常血紅蛋白的可能。簡言之,紅細胞參數(shù)和血紅蛋白組分的表型特征為地貧和異常血紅蛋白病的進一步基因確診提供最重要的線索和依據(jù)。

此研究中2例患者的血紅蛋白組分分析結果均顯示Z7區(qū)高比例、Z1區(qū)Hb QA2異常帶的HbQ-Thailand特征性毛細管電泳結果,也均檢出連鎖遺傳的α-地貧-α4.2缺失,與已報道的HbQ-Thailand一致[9-10]。HbF明顯增高是β-地貧基因缺失的典型特征,而血紅蛋白組分毛細管電泳檢測的HbF和HbQ-Thailand為Z7區(qū)重疊。Z7區(qū)條帶的高比例雖然提示為HbQ-Thailand,但也有可能包含HbF增高的β-地貧基因缺失。本研究的2例患者樣本中均檢出β-地貧基因缺失突變,由此證實高比例HbQ-Thailand掩蓋了同時明顯增高的HbF。此結果也提示,當血紅蛋白組分毛細管電泳分析出現(xiàn)Z7區(qū)高比例,則有必要采用其他方法(如血紅蛋白高效液相色譜法、瓊脂糖凝膠電泳法)對HbF和HbQ-Thailand進行甄別,或同時進行β-地貧基因缺失檢測以防漏檢。

本研究中2例患者的血液學表型均無貧血癥狀(Hb正常),僅表現(xiàn)為MCV、MCH輕度降低,降低程度也小于單純的β-地貧基因缺失雜合子[4,11-12],這很可能是β-地貧基因缺失合并α-地貧-α4.2缺失,從而在一定程度上緩解了α-/β-珠蛋白失衡。另外,患者1為未涉及δ(HBD)基因的β-地貧Taiwanese型缺失,HbA2(α2δ2)增高;而患者2為涉及δ(HBD)基因的β-地貧Gγ+(Aγδβ)0型缺失,故HbA2不增高。

HbQ-Thailand是中國南方人群中較為多見的血紅蛋白病類型[2],但是關于HbQ-Thailand合并β-地貧基因缺失的報道不多。本研究結果提示,很可能是當前臨床上廣泛使用的血紅蛋白毛細管電泳結果中Z7區(qū)的HbQ-Thailand與HbF重疊,導致β-地貧基因缺失的漏檢。本研究還有待通過更多樣本進一步分析總結,為此類復雜血紅蛋白病的遺傳咨詢和基因診斷提供參考和指導。