劉 斌,鄭 軍,西任古麗·孜能

新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,新疆烏魯木齊 830000

膿毒癥是一種嚴(yán)重感染性疾病,可引發(fā)多器官功能障礙,是導(dǎo)致重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)患者病死的首要因素之一[1]。ICU膿毒癥患者因多臟器功能損害、免疫抑制,接受侵襲性操作,成為多重耐藥菌(MDRO)感染的高發(fā)人群[2]。而MDRO感染不僅會(huì)增加抗感染治療難度,加重患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),同時(shí)會(huì)增加死亡風(fēng)險(xiǎn),嚴(yán)重影響患者預(yù)后。微小RNA(miRNA)-21(miR-21)是miRNAs的重要亞型之一,在激活機(jī)體炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)方面具有重要作用[3]。一項(xiàng)關(guān)于肺炎支原體肺炎患兒的研究顯示,血清miR-21水平升高與患兒T淋巴細(xì)胞亞群百分比降低、炎癥因子水平升高有一定關(guān)系,通過監(jiān)測(cè)其水平變化有助于評(píng)估患兒免疫狀態(tài)和炎癥反應(yīng)情況[4]。周巧等[5]研究發(fā)現(xiàn),血清miR-21水平在膿毒癥患者中明顯升高,其在膿毒癥病程中的動(dòng)態(tài)變化可能與機(jī)體炎癥反應(yīng)密切相關(guān),可作為反映膿毒癥嚴(yán)重程度及預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)。但在ICU膿毒癥患者中,miR-21水平與T淋巴細(xì)胞亞群百分比及MDRO感染風(fēng)險(xiǎn)間的具體關(guān)系如何尚缺乏循證依據(jù)?；诖?本研究以ICU膿毒癥患者為研究對(duì)象,檢測(cè)其血清miR-21水平及T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo),旨在為患者M(jìn)DRO感染防控提供參考,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2020年1月至2022年5月本院重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)收治的膿毒癥患者125例納入研究。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[6],體溫<36 ℃或>38 ℃,心率>90次/分鐘,呼吸>20次/分鐘,白細(xì)胞計(jì)數(shù)<4×109/L或>12×109/L,二氧化碳分壓<32 mmHg,滿足以上任意兩條為一般膿毒癥,經(jīng)充分液體復(fù)蘇后低血壓、低組織灌注情況仍未糾正為膿毒癥休克;(2)年齡>18歲;(3)住院時(shí)間≥5 d,入住ICU≥48 h。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有嚴(yán)重肝腎功能障礙;(2)急性缺血性腦卒中;(3)急性冠脈綜合征;(4)有惡性腫瘤;(5)有免疫系統(tǒng)疾病;(6)入組前1個(gè)月內(nèi)使用過免疫抑制劑;(7)入住ICU時(shí)已有MDRO感染;(8)入住ICU 48 h內(nèi)病死;(9)自愿出院。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(批號(hào):KY201912-35)?；颊呋蛑毕涤H屬對(duì)本研究知情同意,并自愿簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1miR-21檢測(cè) 入住ICU當(dāng)天采集外周靜脈血3 mL,離心10 min,離心半徑為8 cm,轉(zhuǎn)速設(shè)置為3 000 r/min,取上清液,存儲(chǔ)于-80 ℃冰箱中待檢。參照上海科博瑞生物科技有限公司提供的miR-21試劑盒說(shuō)明書提取總RNA,稀釋后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),逆轉(zhuǎn)錄后獲取cDNA進(jìn)行稀釋,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)[購(gòu)自儀樂普(北京)醫(yī)療器械股份有限公司,型號(hào):Lepgen-96]檢測(cè)miR-21水平。miR-21上游引物序列為5′-CGGCGGTAGCTTATCAGACTG-3′;下游引物序列為5′-AATGGTTGTTCTCCACACTCTC-3′。以U6為內(nèi)參,上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)體系:cDNA 1 μL,DEPC水3 μL,上游引物0.5 μL,下游引物0.5 μL,SYBR染料5 μL。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,40個(gè)循環(huán),以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-21相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)的檢測(cè) 入住ICU當(dāng)天采集外周靜脈血3 mL,采用賽默飛世爾公司Attune NxT型流式細(xì)胞儀測(cè)定CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比,計(jì)算CD4+/CD8+比值。CD3、CD4、CD8抗體均由上?；钌锟萍加邢薰咎峁?/p>

1.2.3MDRO檢測(cè) 對(duì)臨床使用的3類及以上抗菌藥物同時(shí)耐藥的細(xì)菌,包括耐碳青霉烯類抗菌藥物鮑曼不動(dòng)桿菌、耐碳青霉烯類抗菌藥物腸桿菌、產(chǎn)超廣譜-β內(nèi)酰胺酶細(xì)菌、耐萬(wàn)古霉素腸球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、多重耐藥/泛耐藥銅綠假單胞菌等進(jìn)行檢測(cè)[7]。MDRO的檢測(cè)試劑由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供。

1.3觀察指標(biāo) (1)比較一般膿毒癥、膿毒癥休克患者血清miR-21水平及T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)(CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+比值)。(2)分析ICU膿毒癥患者血清miR-21水平與T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)的相關(guān)性。(3)分析MDRO感染的影響因素。(4)構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型。

2 結(jié) 果

2.1一般膿毒癥、膿毒癥休克患者血清miR-21水平及T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)比較 125例患者miR-21水平及CD3+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+比值分別為(1.81±0.39)mg/L、(49.90±5.48)%、(36.58±4.42)%、(38.77±4.16)%、0.96±0.30。膿毒癥休克患者miR-21水平、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比高于一般膿毒癥患者,CD3+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+比值低于一般膿毒癥患者(P<0.05)。見表1。

表1 一般膿毒癥、膿毒癥休克患者miR-21水平及T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)比較

2.2膿毒癥患者miR-21水平與T淋巴細(xì)胞亞群治療的相關(guān)性 ICU膿毒癥患者miR-21水平與CD3+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+比值均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.842、-0.788、-0.825,P<0.001),與CD8+T淋巴細(xì)胞百分比呈正相關(guān)(r=0.818,P<0.001)。見圖1～4。

2.3MDRO感染單因素分析 125例ICU膿毒癥患者出現(xiàn)MDRO感染37例,發(fā)生率為29.60%(37/125)。性別、年齡、吸煙史、飲酒史、高血壓史、糖尿病史、手術(shù)、連續(xù)性腎臟替代治療、降鈣素原、使用抗菌藥物種類與MDRO感染無(wú)關(guān)(P>0.05)。合并慢性阻塞性肺疾病、機(jī)械通氣、急性生理學(xué)與慢性健康狀況評(píng)分系統(tǒng)Ⅱ(APACHEⅡ)評(píng)分、住ICU時(shí)間、使用糖皮質(zhì)激素、抗菌藥物使用頻率、抗菌藥物持續(xù)使用時(shí)間、miR-21水平、CD3+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+比值與MDRO感染有關(guān)(P<0.05)。見表2。

圖2 miR-21水平與CD4+T淋巴細(xì)胞百分比的相關(guān)性

圖3 miR-21水平與CD8+T淋巴細(xì)胞百分比的相關(guān)性

圖4 miR-21水平與CD4+/CD8+比值的相關(guān)性

2.4MDRO感染的多因素Logistic回歸分析 將合并慢性阻塞性肺疾病、機(jī)械通氣、APACHEⅡ評(píng)分、住ICU時(shí)間、使用糖皮質(zhì)激素、抗菌藥物使用頻率、抗菌藥物持續(xù)使用時(shí)間、miR-21水平、CD3+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+比值進(jìn)行多重共線性檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)miR-21與CD3+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+比值存在多重共線性,手動(dòng)移除CD3+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+比值。以是否發(fā)生MDRO感染作為因變量(發(fā)生=1,未發(fā)生=0),以合并慢性阻塞性肺疾病、機(jī)械通氣、APACHEⅡ評(píng)分、住ICU時(shí)間、使用糖皮質(zhì)激素、抗菌藥物使用頻率、抗菌藥物持續(xù)使用時(shí)間、miR-21作為自變量,納入二分類Logistic回歸模型,采用向前LR法篩選變量,結(jié)果顯示,校正機(jī)械通氣、住ICU時(shí)間、使用糖皮質(zhì)激素后,合并慢性阻塞性肺疾病、APACHEⅡ評(píng)分、抗菌藥物使用頻率、抗菌藥物持續(xù)使用時(shí)間、miR-21仍為ICU膿毒癥患者發(fā)生MDRO感染的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。建立Logistic回歸模型:Logit(P)=-8.672+0.810×合并慢性阻塞性肺疾病+0.964×APACHEⅡ評(píng)分+0.829×抗菌藥物使用頻率+0.885×抗菌藥物持續(xù)使用時(shí)間+1.195×miR-21。模型符合程度采用Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn),P=0.401,擬合度較好。見表3。

表3 MDRO感染的多因素Logistic回歸分析

2.5風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建 根據(jù)Logistic回歸模型中相關(guān)系數(shù)β確定各獨(dú)立危險(xiǎn)因素對(duì)應(yīng)分值,依據(jù)β×2(四舍五入)賦分值,構(gòu)建ICU膿毒癥患者M(jìn)DRO感染的風(fēng)險(xiǎn)模型,見表4。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)模型賦分情況計(jì)算患者M(jìn)DRO感染風(fēng)險(xiǎn)得分,計(jì)算各分值對(duì)應(yīng)感染率,其中>8分為高風(fēng)險(xiǎn),4～8分為中風(fēng)險(xiǎn),<4分為低風(fēng)險(xiǎn),分值越高,感染率越高(P<0.05),見表5。

表5 ICU膿毒癥患者M(jìn)DRO感染風(fēng)險(xiǎn)分層

3 討 論

近年來(lái)隨著抗菌藥物的廣泛使用,細(xì)菌耐藥問題逐漸凸顯。目前關(guān)于ICU患者M(jìn)DRO感染風(fēng)險(xiǎn)已逐漸得到重視,已有多項(xiàng)關(guān)于ICU患者M(jìn)DRO感染危險(xiǎn)因素的報(bào)道[8-10],但針對(duì)ICU膿毒癥患者M(jìn)DRO感染防治的報(bào)道較少。本研究統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),125例ICU膿毒癥患者M(jìn)DRO感染發(fā)生率為29.60%,略低于陳利紅等[11]報(bào)道的32.9%,但仍處于較高水平。如何從生理、病理機(jī)制方面控制MDRO感染風(fēng)險(xiǎn)已成為臨床研究的重要方向之一。

膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展并不依賴于機(jī)體細(xì)菌和毒素的持續(xù)存在,而與機(jī)體過度炎癥反應(yīng)、免疫紊亂等有關(guān)。隨著膿毒癥病情進(jìn)展,機(jī)體特征性補(bǔ)體系統(tǒng)激活,先天性免疫系統(tǒng)過度活化,炎性介質(zhì)過度釋放,刺激機(jī)體釋放氧自由基,致使機(jī)體調(diào)控機(jī)制失調(diào),炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加劇,造成器官功能損害,誘發(fā)膿毒癥休克,甚至導(dǎo)致患者死亡[12-13]。miR-21主要位于17q 23.2染色體FRA17脆性區(qū)域上,擁有自己的啟動(dòng)子區(qū)域,可在血清中穩(wěn)定存在,不僅具有調(diào)控炎癥因子表達(dá)的作用,還可作用于炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通絡(luò)的其他關(guān)鍵分子[14]。楊霞虹等[15]指出,miR-21的表達(dá)與嗜酸性粒細(xì)胞性食管炎、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、炎癥性腸病等多種炎性疾病的發(fā)生、進(jìn)展有關(guān),有望作為炎性疾病治療的新靶點(diǎn)。T淋巴細(xì)胞是機(jī)體細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞,正常情況下其數(shù)量保持動(dòng)態(tài)平衡,但隨著病原菌的侵襲,會(huì)出現(xiàn)異常表達(dá)。本研究中膿毒癥休克患者miR-21水平、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比高于一般膿毒癥患者,CD3+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+比值低于一般膿毒癥患者,與關(guān)炳星等[16]、李偉超等[17]研究結(jié)果相符,表明ICU膿毒癥患者同時(shí)存在機(jī)體炎癥及細(xì)胞免疫功能紊亂,且可能參與病情進(jìn)展。進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)ICU膿毒癥患者miR-21水平與CD3+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+/CD8+比值呈負(fù)相關(guān),與CD8+T淋巴細(xì)胞百分比呈正相關(guān)。miR-21高表達(dá)導(dǎo)致機(jī)體全身性炎癥反應(yīng)爆發(fā),刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞釋放過量的腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-8、白細(xì)胞介素-6等,誘發(fā)機(jī)體防御性炎癥反應(yīng)過度,加劇病情進(jìn)展,同時(shí)可通過影響MAPK、MyD88通路致使機(jī)體免疫功能紊亂,T淋巴細(xì)胞亞群失衡[18-19]。

安陽(yáng)等[20]在一項(xiàng)老年肺炎患者中的研究發(fā)現(xiàn),MDRO感染患者細(xì)胞免疫受到明顯抑制,干擾素-γ分泌受限,無(wú)法正常吞噬、殺傷病原體,致使炎癥反應(yīng)加重,出現(xiàn)組織損害。本研究結(jié)果顯示,miR-21高表達(dá)會(huì)增加ICU膿毒癥患者M(jìn)DRO感染風(fēng)險(xiǎn),可能是因?yàn)閙iR-21表達(dá)上調(diào)不僅會(huì)加劇機(jī)體炎癥反應(yīng),還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能降低,致使機(jī)體對(duì)病原菌的免疫力大幅度下降,從而導(dǎo)致MDRO感染率升高。進(jìn)一步建立Logistic回歸模型:Logit(P)=-8.672+0.810×合并慢性阻塞性肺疾病+0.964×APACHEⅡ評(píng)分+0.829×抗菌藥物使用頻率+0.885×抗菌藥物持續(xù)使用時(shí)間+1.195×miR-21,經(jīng)Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)擬合度較好,而且風(fēng)險(xiǎn)分層分析顯示分值越高,感染率越高。因此,臨床在評(píng)估患者病情狀況、合理應(yīng)用抗菌藥物的基礎(chǔ)上應(yīng)加強(qiáng)對(duì)miR-21的監(jiān)測(cè),以降低MDRO感染風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述,ICU膿毒癥患者miR-21表達(dá)不僅與病情進(jìn)展有關(guān),還與T淋巴細(xì)胞亞群百分比密切相關(guān);miR-21高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致MDRO感染風(fēng)險(xiǎn)增加,檢測(cè)miR-21表達(dá)有利于指導(dǎo)臨床制訂MDRO感染防治策略。但本研究的局限性在于,未進(jìn)一步明確不同miR-21水平患者M(jìn)DRO感染防治效果,這可以作為下一步研究的方向。