孟昭成 王麗欣 呂雅琳 江水 李振興 陳官芝

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科,山東 青島 266003; 2 中國海洋大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室)

金黃色葡萄球菌(S.aureus)是人類皮膚細(xì)菌感染的主要致病菌［1-3］,痤瘡丙酸桿菌(C.acnes)與痤瘡發(fā)病機(jī)制的多個(gè)環(huán)節(jié)密切相關(guān)［4］。目前治療細(xì)菌感染的常規(guī)方法是使用抗生素,但隨著細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥性的增加［5］,抗生素的替代治療逐漸引起臨床上的重視。植物精油提取自芳香植物中,具有抗菌、抗炎、抗病毒等藥理活性,其抗菌特性不易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥,在特定領(lǐng)域具有替代抗生素的潛力［6］。松油烯-4-醇(T4O)為茶樹油的主要化合物,在茶樹油中的含量占比超過35%,具有很強(qiáng)的抗菌和抗炎活性,是茶樹油治療尋常痤瘡的重要作用成分［7-9］。α-紅沒藥醇(Bis)最初提取于洋甘菊中,因其具有舒緩皮膚作用,被應(yīng)用到許多化妝品配方中［10］。此外,Bis還具有抗炎及促進(jìn)傷口愈合的作用［11］,以及與抗生素諾氟沙星聯(lián)合治療S.aureus感染時(shí)具有協(xié)同作用［12］。目前T4O和Bis均被應(yīng)用在皮膚外用制劑中,但有關(guān)T4O、Bis聯(lián)用的抑菌作用則未見報(bào)道。本研究通過測定T4O、Bis聯(lián)用對(duì)S.aureus及C.acnes的抑菌作用,為開發(fā)新型抑菌產(chǎn)品成分配方提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

T4O購自上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司,Bis購自上海麥克林生化科技有限公司,吐溫80、2,3,5-三苯基四氮唑購自北京索萊寶有限公司,鹽酸米諾環(huán)素購買于浙江海正輝瑞制藥有限公司,金黃色葡萄球菌(ATCC 43300)、痤瘡丙酸桿菌(ATCC 11827)購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司,MH肉湯培養(yǎng)基(MHB)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FT)、哥倫比亞血平板購自青島海博生物有限公司。

Sigma3K15離心機(jī)購自曦瑪離心機(jī)(上海)有限公司,Zetasizer Nano ZS90納米粒度電位儀購自英國Malvern公司,NanoDropTMOne微量UV-Vis分光光度計(jì)、全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自美國賽默飛公司。

1.2 S.aureus和C.acnes的培養(yǎng)

將S.aureus菌液在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上畫線接種,于37 ℃恒溫箱中過夜培養(yǎng),挑取單菌落至裝有MHB的試管中,37 ℃下于200 r/min的搖床中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期以后備用。將C.acnes菌液在哥倫比亞血平板上畫線接種,37 ℃下于厭氧箱中培養(yǎng)48 h,挑取單菌落至裝有FT的試管中, 37 ℃下于厭氧箱中靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后備用。

1.3 T4O與Bis對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)菌株的最小抑菌濃度(MIC)的測定和部分抑菌濃度指數(shù)(FICI)的計(jì)算

將對(duì)數(shù)生長期的兩種細(xì)菌用MHB(S.aureus)和FT(C.acnes)分別稀釋為濃度每升約1×109個(gè)菌落形成單位(CFU)的菌懸液。參考BELLIO等［13］的方法,在無菌96微孔板中用MHB將Bis從1～11列進(jìn)行二倍梯度稀釋,每孔溶液體積為100 μL,使質(zhì)量濃度分別達(dá)到25.00、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0.05和0.02 g/L;用MHB將T4O從A～G行進(jìn)行二倍梯度稀釋,使終質(zhì)量濃度達(dá)到10.00、5.00、2.50、1.25、0.62、0.31和0.16 g/L;在上述各孔中添加100 μLS.aureus懸液,于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h。另外取一塊無菌96微孔板重復(fù)上述操作,在各孔中添加100 μLC.acnes懸液,37 ℃下于恒溫靜置厭氧培養(yǎng)48 h。在上述濃度梯度中,肉眼可觀察到的無實(shí)驗(yàn)菌株生長的最低藥物濃度即為MIC。將0.2 mg/g鹽酸米諾環(huán)素作為質(zhì)控藥物,重復(fù)上述操作,實(shí)驗(yàn)菌株的MIC在0.05～0.20 mg/L之間,則認(rèn)為上述實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果可信。采用FICI判斷T4O與Bis聯(lián)用的效果,其計(jì)算方法為FICI=MICT4O(聯(lián)用)/MICT4O(單用)+MICBis(聯(lián)用)/MICBis(單用)。FICI≤0.5為協(xié)同作用,0.5～1為相加作用,1～4為無相互作用,≥4為拮抗作用［14］。

1.4 繪制T4O與Bis聯(lián)用對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)菌株時(shí)間-殺菌曲線

將對(duì)數(shù)生長階段的S.aureus用MHB稀釋至1×109CFU/L,取15 mL菌液4 ℃ 6 000 r/min離心10 min,去除上清液以后加入12 mL MHB并吹打均勻,分別平均分裝至3個(gè)無菌試管中,標(biāo)記為MIC1、2×MIC1及陰性對(duì)照1組。另取對(duì)數(shù)生長階段的C.acnes以FT稀釋至1×109CFU/L后重復(fù)上述操作。于S.aureus的MIC1組試管中加入3.13 mg T4O及1 mg Bis,2×MIC1組試管中加入6.25 mg T4O及1 mg Bis;于C.acnes的MIC1組試管中加入1.56 mg T4O及1 mg Bis,2×MIC1組試管中加入3.13 mg T4O及1 mg Bis;兩種菌株的陰性對(duì)照1組中均加入7.2 μL生理鹽水。最后所有組中各加入50 μL吐溫80,再用每種菌株對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基補(bǔ)充至總體積均為5 mL,充分振蕩混勻。S.aureus的各組在37 ℃下于200 r/min搖床中培養(yǎng),C.acnes各組37 ℃下于厭氧箱中靜置培養(yǎng),每2 h以平板涂布計(jì)數(shù)法測量一次CFU,觀察24 h并繪制時(shí)間-殺菌曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)取均值。

1.5 T4O與Bis聯(lián)用對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)菌株表面Zeta電位(ZP)的影響

將對(duì)數(shù)生長階段的兩種菌懸液用MHB(S.aureus)和FT(C.acnes)稀釋至1×109CFU/L,使用1.4中方法進(jìn)行分組,每種菌株均分為MIC2、2×MIC2及陰性對(duì)照2組,4 h后每組分別取1 mL菌液,于4 ℃下6 500 r/min離心15 min后。收集菌體用無菌PBS重懸、洗滌2次,用Zetasizer Nano ZS90納米粒度電位儀檢測兩種實(shí)驗(yàn)菌株表面ZP。

1.6 T4O與Bis聯(lián)用對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)菌株細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)泄漏的影響

將1.5中各組培養(yǎng)4 h后的兩種菌株分別取1 mL,于4 ℃下6 500 r/min離心5 min,取上清液,使用微量UV-Vis分光光度計(jì)測定各組上清液在波長260、280 nm處的吸光度(A)值,分別代表菌株細(xì)胞內(nèi)核酸及蛋白質(zhì)的含量。

1.7 T4O與Bis聯(lián)用對(duì)S.aureus呼吸鏈脫氫酶活性的影響

參考NING等［15］的方法檢測呼吸鏈脫氫酶活性。按1.4中方法制備S.aureus的MIC3、2×MIC3及陰性對(duì)照3組的菌液,每組取2 mL菌液后均依次加入0.05 mol/L pH 8.6的Tris-HCl緩沖液以及0.1 mol/L葡萄糖溶液和1 g/L 2,3,5-三苯基四氮唑溶液各4 mL, 37 ℃下于200 r/min搖床振蕩4 h后,各組中均加入200 μL濃硫酸終止反應(yīng);最后均加入5 mL正丁醇混勻,靜置5 min后6 500 r/min離心5 min,取上清液。使用酶標(biāo)儀測定各組上清液在波長490 nm處吸光度值;吸光度值越高,代表S.aureus呼吸鏈脫氫酶的活性越高。

1.8 透射電鏡觀察T4O與Bis聯(lián)用對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)菌株形態(tài)的影響

將1.5中各組培養(yǎng)4 h后的兩種菌株分別取1 mL,于4 ℃下以6 500 r/min離心5 min,用無菌PBS洗滌菌體2次,后加入1 mL 25 g/L的戊二醛固定,置于4 ℃冰箱6 h后,使用負(fù)染法染色,用透射電鏡觀察菌株形態(tài)并拍照。

1.9 T4O與Bis聯(lián)用對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)菌株細(xì)菌生物膜的破壞作用

將對(duì)數(shù)生長階段的兩種菌懸液分別加到兩塊無菌96微孔板的1～3列中,每孔200 μL,S.aureus在37 ℃下于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)72 h后,C.acnes在37 ℃下于厭氧培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)96 h后,仔細(xì)去除菌液后沖洗培養(yǎng)孔3次,去除多余的水分。將T4O與Bis用質(zhì)量濃度5 g/L的吐溫80-生理鹽水緩沖液按1.4中方法配置,每種菌株均分為MIC4、2×MIC4及陰性對(duì)照4組,將各組分別加至上述1～3列微孔中,每孔200 μL, 37 ℃下于恒溫培養(yǎng)箱中靜置24 h。去除微孔中液體,生理鹽水沖洗3次后室溫干燥,向每孔中加入200 μL質(zhì)量濃度0.1 g/L的結(jié)晶紫溶液,于室溫下染色30 min后小心去除染色液并用蒸餾水清洗3次,37 ℃下放置30 min后加入200 μL無水乙醇,用酶標(biāo)儀測定兩板1～3列在波長595 nm處的吸光度值;吸光度值越高,代表微孔中殘留生物膜越多。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 T4O與Bis單獨(dú)及聯(lián)用時(shí)對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)菌株的抗菌作用

T4O單獨(dú)用藥時(shí)對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)菌株的MIC均為2.5 g/L,聯(lián)用時(shí)對(duì)S.aureus的MIC降至0.62 g/L,對(duì)C.acnes的MIC降至0.31 g/L;Bis單獨(dú)用藥時(shí)對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)菌株的MIC均>12.5 g/L,聯(lián)用時(shí)對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)菌株的MIC降至0.39～1.56 g/L。T4O、Bis聯(lián)用時(shí)對(duì)S.aureus和C.acnes的FICI值均<0.5,表明T4O與Bis聯(lián)用對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)菌株表現(xiàn)為協(xié)同抑制作用。

2.2 T4O與Bis聯(lián)用對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)菌株的抑制作用

雙因素方差分析結(jié)果顯示,組別(藥物濃度)、時(shí)間、組別與時(shí)間交互作用對(duì)于S.aureus和C.acnes的抑制有明顯影響(F組別=208.06、215.92,F時(shí)間=56.31、66.23,F組別*時(shí)間=63.52、76.15,P<0.01)。Tukey法結(jié)果顯示,S.aureus自2 h時(shí)及其后各時(shí)間點(diǎn)的菌落濃度三組間比較均具有顯著差異(F=25.56～598.17,P<0.05),C.acnes自2 h時(shí)及其后各時(shí)間點(diǎn)的菌落濃度三組間比較也具有顯著差異(F=39.84～617.08,P<0.05)。見圖1。

2.3 T4O與Bis聯(lián)用時(shí)對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)菌株表面ZP的影響

S.aureus的MIC2、2×MIC2組和陰性對(duì)照2組菌株表面ZP分別為(-1.060±0.032)、(-1.167±0.072)、(-0.804±0.132)mV,三組間比較差異有顯著性(F=26.57,P<0.01);C.acnes的MIC2、2×MIC2組以及陰性對(duì)照2組菌株表面的ZP分別為(-1.223±0.093)、(-1.360±0.185)、(-0.760±0.076)mV,三組間比較差異有顯著性(F=18.29,P<0.05)。

2.4 T4O與Bis聯(lián)用對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株細(xì)胞內(nèi)核酸及蛋白類泄漏的影響

S.aureus的MIC2、2×MIC2組和陰性對(duì)照2組A260值分別為0.990±0.147、1.157±0.092、0.687±0.087,A280值分別為1.270±0.076、1.340±0.070、0.963±0.040,三組間A260、A280值比較差異均有顯著性(F=13.50、29.53,P<0.05);C.acnes的MIC2組以及2×MIC2組與陰性對(duì)照2組A260值分別為1.155±0.145、1.268±0.170、0.775±0.068,A280值分別為0.930±0.082、1.253±0.076、0.627±0.153,三組間A260、A280值差異均具有顯著性(F=14.67、24.71,P<0.05)。

2.5 T4O與Bis聯(lián)用對(duì)S.aureus呼吸鏈脫氫酶活性的影響

S.aureus的MIC3、2×MIC3組和陰性對(duì)照3組A490值分別為0.167±0.040、0.109±0.025、0.761±0.087,三組之間A490值比較差異具有顯著性(F=120.80,P<0.01)。

2.6 透射電鏡觀察T4O與Bis聯(lián)用對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)菌株形態(tài)的影響

S.aureus的陰性對(duì)照2組菌株可見細(xì)胞完整,胞質(zhì)均勻;MIC2組處理4 h后,可見細(xì)菌細(xì)胞中央凹陷,顏色變淡,說明細(xì)胞膜遭到破壞,胞內(nèi)物質(zhì)外流。C.acnes的陰性對(duì)照2組菌株可見細(xì)胞完整,胞膜清晰;MIC2組處理4 h后,可見細(xì)菌細(xì)胞邊界模糊,菌體粗細(xì)不均勻。見圖2。

圖2 經(jīng)T4O和Bis聯(lián)合處理的S.aureus及C.acnes透射電鏡圖像

2.7 T4O與Bis聯(lián)用對(duì)于實(shí)驗(yàn)菌株生物膜的破壞作用

S.aureus的MIC4、2×MIC4組與陰性對(duì)照4組生物膜染色液A595值分別為0.272±0.032、0.229±0.023、0.426±0.037,三組間A595值進(jìn)行比較差異有顯著意義(F=44.41,P<0.01);C.acnes的MIC4、2×MIC4組與陰性對(duì)照4組生物膜染色液A595值分別為0.333±0.081、0.310±0.073、0.466±0.069,三組之間A595值進(jìn)行比較差異具有顯著性(F=5.12,P<0.05)。

3 討 論

已有報(bào)道指出,T4O對(duì)S.aureus和C.acnes具有明確的抑制作用［16-18］,文獻(xiàn)關(guān)于T4O抗S.aureus作用的MIC為1.25～2.50 g/L［19］,與本研究結(jié)果相符。本研究T4O與Bis聯(lián)用時(shí),T4O對(duì)S.aureus以及C.acnes的MIC分別為0.62、0.31 g/L。Bis為0.39、0.78、1.56 g/L三個(gè)濃度時(shí)對(duì)兩種菌株均產(chǎn)生抑制作用,其余濃度對(duì)兩種菌株均無抑制作用,因此Bis的MIC為0.39～1.56 g/L,即藥物濃度過高或者過低均會(huì)降低兩藥的協(xié)同抑菌效果,并且Bis的抗炎作用也有類似的最佳濃度范圍［20］。綜合兩種實(shí)驗(yàn)菌株的時(shí)間-殺菌曲線可發(fā)現(xiàn),T4O與Bis聯(lián)用時(shí)對(duì)兩種菌株抑制效果與藥物濃度呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,二者在MIC時(shí)對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)菌均有抑菌及部分殺菌作用,2倍MIC時(shí)對(duì)C.acnes有完全殺菌作用,但不能完全殺滅S.aureus。雖然兩藥聯(lián)用時(shí)2倍MIC的抑菌效果更佳,但是MIC也可提供長達(dá)24 h的持續(xù)抑菌作用,故本研究透射電鏡只觀察兩藥濃度為MIC時(shí)對(duì)兩種細(xì)菌抑制作用的影響。

細(xì)菌表面電位是維持最佳細(xì)胞功能的關(guān)鍵物理特征,ZP測量技術(shù)可被視為計(jì)算細(xì)菌表面電位的間接工具。本研究發(fā)現(xiàn),T4O與Bis聯(lián)用通過降低兩種實(shí)驗(yàn)菌的ZP發(fā)揮抑制作用,CUTRO等［21］同樣發(fā)現(xiàn)精油能夠降低細(xì)菌的ZP值。呼吸鏈?zhǔn)羌?xì)菌能量代謝的重要環(huán)節(jié),2,3,5-三苯基四氮唑可以與細(xì)菌中呼吸鏈脫氫酶發(fā)生還原反應(yīng),轉(zhuǎn)變?yōu)樽畲笪辗逶诓ㄩL490 nm處的紅色物質(zhì),故認(rèn)為A490值與呼吸鏈脫氫酶活性呈正相關(guān)［22］。且由于C.acnes為厭氧菌,體內(nèi)缺乏呼吸鏈脫氫酶,故本研究僅針對(duì)S.aureus進(jìn)行了呼吸鏈脫氫酶活性的檢測。本研究結(jié)果顯示MIC3組A490值較陰性對(duì)照3組顯著降低,說明兩藥聯(lián)用且濃度為MIC時(shí)即可抑制S.aureus呼吸鏈脫氫酶活性。

周靜等［18］使用形態(tài)學(xué)觀察法直觀地發(fā)現(xiàn)T4O可使S.aureus及C.acnes干癟皺縮、出現(xiàn)畸形,從而達(dá)到抑制作用。本研究通過透射電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)T4O、Bis聯(lián)用后兩種菌體結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,但其內(nèi)容物減少,結(jié)合MIC2組A260、A280值較陰性對(duì)照2組顯著升高,說明MIC2組兩種菌株細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白泄漏增加,推測這種改變可能是由于細(xì)菌膜變得滲透性更高導(dǎo)致。使用結(jié)晶紫對(duì)微量滴定板孔內(nèi)形成的生物膜染色是分析生物膜形成、抑制或根除的最常用定量方法,本研究中MIC4組A595值較陰性對(duì)照4組顯著降低,表明對(duì)應(yīng)的微孔內(nèi)生物膜含量明顯減少,可以推斷兩藥聯(lián)用且濃度為MIC時(shí)即可明顯破壞兩種細(xì)菌的生物膜。

目前研究發(fā)現(xiàn),S.aureus及C.acnes抗藥性的機(jī)制主要為發(fā)生基因突變和形成生物膜等［23］。本研究驗(yàn)證的T4O聯(lián)合Bis的協(xié)同抗菌作用機(jī)制與其他植物精油單體成分的抑菌機(jī)制類似,均可破壞細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和生物膜,從而減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)所用菌株S.aureus標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 43300是耐甲氧西林的S.aureus,而C.acnes標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 11827并非耐藥株,并且缺少在臨床患者皮損中分離耐藥菌株的進(jìn)一步驗(yàn)證,但從聯(lián)用抑菌機(jī)制上推測,對(duì)臨床分離的耐藥株也應(yīng)有類似的抑制作用。FORRER等［24］報(bào)道口臭相關(guān)的細(xì)菌摩爾梭桿菌對(duì)茶樹油和Bis聯(lián)用敏感,認(rèn)為該化合物組合可以開發(fā)口腔保健產(chǎn)品。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)T4O與Bis聯(lián)用的抑菌潛力,兩者或有望成為針對(duì)皮膚S.aureus及C.acnes感染治療產(chǎn)品的配方組合成分。

作者聲明：孟昭成、李振興、呂雅琳參與了研究設(shè)計(jì);孟昭成、陳官芝、王麗欣、江水參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文,且均聲明不存在利益沖突。