張學(xué)明 王惠 錢冬萌 王斌

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266071)

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一,患者的發(fā)病率和死亡率持續(xù)攀升［1］。盡管手術(shù)、放療、化療等方法可延長患者生存,但副作用和治療失敗的問題仍然存在。腫瘤免疫療法,尤其是全細胞疫苗研究備受關(guān)注［2-3］。通過對患者癌細胞進行體外培養(yǎng)和處理,可制備出保留免疫原性的非活性全癌細胞顆粒疫苗。然而,由于腫瘤細胞對免疫系統(tǒng)的抑制作用,使腫瘤細胞制備的疫苗治療效果受到影響［4］。

MYC家族由c-MYC、N-MYC和L-MYC組成,其中c-MYC和N-MYC在許多人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色［5］。MYC可以促使腫瘤細胞增殖并抑制免疫細胞浸潤［6］。已有研究表明靶向抑制MYC可增強黑色素瘤及神經(jīng)母細胞瘤的免疫原性,但在肺腺癌(LUAD)領(lǐng)域相關(guān)研究尚缺乏［7］。(+)-JQ1以及I-BET151均可以靶向抑制小鼠細胞中c-Myc和N-Myc表達,兩者聯(lián)合使用后,其抑制作用會增強［7-9］。本研究通過數(shù)據(jù)庫分析MYC擴增對人類LUAD細胞免疫原性的影響,同時在小鼠模型中通過給予靶向抑制Myc的小鼠Lewis肺癌(LLC)全細胞疫苗,探索其在激活小鼠免疫系統(tǒng)殺傷LLC細胞方面的效果。

1 材料和方法

1.1 LUAD組織和癌旁正常組織中免疫細胞浸潤豐度的比較

獲取TCGA數(shù)據(jù)庫中LUAD患者(包含501例LUAD組織樣本和54例癌旁正常組織樣本)的基因表達矩陣,以LUAD組織中c-MYC和N-MYC表達量的中位數(shù)為界,將LUAD患者分為c-MYC高、低表達組以及N-MYC高、低表達組。并采用CIBERSORT R腳本計算LUAD組織和癌旁正常組織中不同免疫細胞的浸潤豐度,比較N-MYC高、低表達組之間以及c-MYC高、低表達組之間不同免疫細胞浸潤豐度。

1.2 試劑及動物和細胞

(+)-JQ1和I-BET151購自上海陶術(shù)生物科技公司。RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒購自上海賽默飛世爾科技(中國)有限公司,干擾素-γ(IFN-γ)ELISA試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。6周齡雌性C57BL/6N小鼠45只,體質(zhì)量17～18 g,購自北京維通利華公司,許可證號:SCXK(京)2021-0006。小鼠LLC細胞系(上海ATCC公司)置于含體積分數(shù)為0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、雙抗(100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)混合溶液中,于37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2孵箱中進行培養(yǎng)。

1.3 CCK-8實驗確定LLC細胞的最佳紫外線照射時長

將生長狀態(tài)良好并占據(jù)皿底面積大約40%～50%的LLC細胞分為處理組和對照組,置于直徑為10 cm的圓形培養(yǎng)皿當中。處理組LLC細胞的DMEM培養(yǎng)基中加入0.4 μmol/L的(+)-JQ1和0.4 μmol/L的I-BET151,對照組LLC細胞置于常規(guī)DMEM培養(yǎng)基中,均培養(yǎng)4 d。然后將兩組細胞置于光學(xué)顯微鏡下觀察細胞的形態(tài);在培養(yǎng)皿中將兩組細胞均制備成濃度1×1010/L、高度1 mm的均勻懸液,置于搖床上以50 r/min的速度晃動細胞懸液,同時用波長為254 nm的紫外線對其進行照射,照射時長分別為0、5、10、15、20、25、30 min。在照射LLC細胞不同時長后的第0、12、24小時,使用CCK-8試劑盒檢測LLC細胞的吸光度值,以評估LLC細胞的增殖活性。操作嚴格遵循說明書執(zhí)行,實驗重復(fù)3次,結(jié)果取均值。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測LLC細胞中Myc和PD-L1 mRNA的表達

將培養(yǎng)4 d的對照組和處理組LLC細胞,用PBS制備成濃度為1×1010/L的均勻細胞懸液,紫外線照射兩組LLC細胞15 min后,立即用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,加入含有c-Myc、N-Myc和PD-L1引物的預(yù)混液進行RT-qPCR擴增。采用2-△△CT方法計算LLC細胞中目標mRNA的相對表達水平,引物名稱及其序列見表1。每次實驗設(shè)置3個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次,結(jié)果取均值。

表1 引物名稱及其序列

1.5 小鼠腫瘤模型的構(gòu)建

將培養(yǎng)4 d的對照組和處理組LLC細胞,用PBS制備成濃度為1×1010/L的均勻細胞懸液。紫外線照射兩組LLC細胞15 min后,立即與PBS以1∶1混合,得到對照組和處理組的LLC全細胞疫苗,4 ℃下儲存。將45只C57BL/6N雌性小鼠隨機均分為未免疫組(PBS組)、單純紫外線疫苗組(Irra組)、紫外線試劑處理疫苗組(Irra處理組),每組15只。所有小鼠第1天于左腋窩皮下接種5×105個LLC細胞,PBS組小鼠第5、12、19天于右側(cè)大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射200 μL PBS,Irra組小鼠第5、12、19天于右側(cè)大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射5×109/L對照LLC全細胞疫苗200 μL,Irra處理組小鼠第5、12、19天于右側(cè)大腿內(nèi)側(cè)肌肉注射5×109/L處理組LLC全細胞疫苗200 μL。所有小鼠注射完成后均常規(guī)飼養(yǎng)。

每組小鼠隨機取出5只,隔1 d測量1次體質(zhì)量,隔2 d測量1次腫瘤體積,均測量至第25天,計算腫瘤體積(V)。V=腫瘤最長徑×腫瘤最短徑2×0.52。每組小鼠再隨機取出5只,以腫瘤直徑達到倫理閾值(15～20 mm)時為死亡終點,分別行全麻后脫頸處死。記錄小鼠生存期,采用Kaplan-Meier法進行生存分析。

1.6 ELISA方法檢測各組小鼠血清中促炎性因子TNF-α和IFN-γ的表達水平

每組小鼠隨機取出5只,在接種LLC全細胞疫苗第25天時,麻醉后眼球取血,脫頸處死,解剖分離小鼠的脾臟和腫瘤組織。將小鼠血液樣本室溫下放置2 h,置于水平離心機上4 ℃下以3 000 r/min離心15 min,收集血清,使用ELISA試劑盒檢測血清中TNF-α和IFN-γ水平,測試步驟嚴格按照試劑盒說明書中的要求進行。

1.7 流式細胞術(shù)檢測小鼠脾臟以及腫瘤組織中CD3+CD8+/CD3+ T細胞比值

將3組小鼠的脾臟和腫瘤組織研磨后,以200目銅網(wǎng)過濾得到單細胞懸液。將細胞接種于96孔板中,每孔約1×106個細胞,每孔細胞中加入混合抗體(PE anti-mouse CD3、PE anti-mouse CD4、PE anti-mouse CD8),4 ℃下孵育30 min。置于流式細胞儀上進行檢測,采用FlowJo軟件(版本10.8.1)分析CD3+CD8+/CD3+T細胞比值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 LUAD組織和癌旁正常組織中免疫細胞浸潤豐度比較

通過TCGA數(shù)據(jù)庫計算LUAD患者的LUAD組織與癌旁正常組織中免疫細胞的浸潤豐度,結(jié)果顯示,與癌旁正常組織相比,LUAD組織內(nèi)CD8+T細胞、CD4+記憶T細胞、NK細胞及M0巨噬細胞的浸潤豐度顯著性降低(W=9 276～20 086,P<0.05),調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)的浸潤豐度顯著升高(W=18 672,P<0.05);相較于N-MYC低表達組,N-MYC高表達組的激活CD4+記憶T細胞與激活NK細胞的浸潤豐度顯著降低(W=28 233、27 990,P<0.05),Tregs細胞的浸潤豐度顯著性升高(W=36 074,P<0.05);c-MYC高、低表達組之間比較,免疫細胞的浸潤豐度均無顯著差異(P>0.05)。

2.2 LLC細胞的最佳紫外線照射時長

光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),與對照組相比,處理組LLC細胞的數(shù)量明顯減少,細胞聚集程度明顯降低(圖1)。重復(fù)測量方差分析顯示,測量時點、照射時長及兩者的交互作用對細胞的吸光度值均有顯著影響(F=5.51～188.97,P<0.05)。單獨效應(yīng)分析顯示,在相同測量時點下,各組LLC細胞在照射時長為0、5、10、15 min時的吸光度值比較,差異均有顯著性(P<0.05)。在相同測量時點下,各組LLC細胞在照射時長為15、20、25、30 min時的吸光度值比較,差異均無顯著性(P>0.05);在相同的照射時長下,即15、20、25、30 min,各組LLC細胞在第0、12、24小時時的吸光度值比較,差異均無顯著性(P>0.05),見圖2。因此在經(jīng)過紫外線照射15 min的后第0小時時,兩組LLC細胞均失去了活性,故后續(xù)采用紫外線照射15 min后第0小時的LLC細胞制備LLC全細胞疫苗。

A:對照組,B:處理組,200倍

A:對照組,B:處理組

2.3 Myc與PD-L1 mRNA在對照組和處理組中的表達差異

RT-qPCR結(jié)果顯示,與對照組相比較,處理組LLC細胞c-Myc、N-Myc、PD-L1 mRNA相對表達水平顯著降低(t=6.26～13.51,P<0.05),見表2。

表2 兩組LLC細胞的c-Myc、N-Myc、PD-L1 mRNA相對表達水平比較

2.4 小鼠模型中體質(zhì)量、腫瘤體積和生存期的分析

各組小鼠在接種LLC全細胞疫苗4～5 d后,左側(cè)腋窩處均出現(xiàn)腫瘤腫塊。重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示,測量時間對小鼠體質(zhì)量具有顯著影響(F=288.08,P<0.05),而分組和分組與測量時間交互作用對小鼠的體質(zhì)量均無顯著影響(P>0.05);單獨效應(yīng)分析顯示,同一個測量時點,3組小鼠的體質(zhì)量比較無顯著差異(P>0.05)。見圖3A。分組、測量時間以及兩者交互作用對小鼠的腫瘤體積均有顯著性影響(F=2.32～908.04,P<0.05);單獨效應(yīng)分析顯示,在接種LLC細胞后第19、22、25天時,Irra組小鼠腫瘤體積均顯著小于PBS組,Irra處理組小鼠腫瘤體積均顯著小于Irra組(P<0.05),見圖3B。

A、B、C分別為各組小鼠體質(zhì)量、腫瘤體積和生存期比較

Kaplan-Meier法分析各組小鼠的生存率,經(jīng)過Log-rank檢驗,3組小鼠的生存曲線比較差異有顯著性(χ2=20.60,P<0.05),其中Irra組優(yōu)于PBS組,Irra處理組優(yōu)于Irra組(P<0.05),見圖3C。

2.5 各組小鼠血清TNF-α和IFN-γ表達水平比較

PBS組、Irra組和Irra處理組小鼠血清TNF-α的表達水平分別為(5.81±0.47)、(9.76±1.01)、(19.82±1.09)ng/L,PBS組、Irra組和Irra處理組小鼠血清IFN-γ表達水平分別為(19.54±2.44)、(35.84±1.75)、(75.31±4.83)ng/L。3組小鼠血清中TNF-α和IFN-γ的表達水平比較均有顯著差異(F=320.70、381.10,P<0.05),其中Irra組兩個指標均顯著高于PBS組,Irra處理組均顯著高于Irra組(P<0.05)。

2.6 各組小鼠脾臟和腫瘤內(nèi)CD3+CD8+/CD3+ T細胞比值比較

PBS組、Irra組和Irra處理組小鼠脾臟組織中CD3+CD8+/CD3+T細胞比值分別為0.12±0.02、0.16±0.01、0.22±0.02,3組小鼠腫瘤組織中分別為0.13±0.01、0.21±0.02、0.30±0.01。3組小鼠脾臟和腫瘤中CD3+CD8+/CD3+T細胞比值比較均有顯著統(tǒng)計意義(F=54.83、143.70,P<0.05),其中Irra組脾臟和腫瘤組織中CD3+CD8+/CD3+T細胞比值均顯著高于PBS組,Irra處理組均顯著高于Irra組(P<0.05)。見圖4。

A:小鼠脾臟組織,B:小鼠腫瘤組織

3 討 論

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病和死亡率不斷上升。傳統(tǒng)治療方法,如手術(shù)、放療和化療,受到副作用和治療失敗的嚴重制約。近年來,腫瘤全細胞疫苗因其保留腫瘤細胞所有抗原逐漸受到關(guān)注。然而,由于對免疫系統(tǒng)的抑制作用,全細胞疫苗的治療效果仍然受到很大限制。因此,尋找一種簡單有效的方法以提高腫瘤全細胞疫苗的免疫原性變得尤為重要。

已有的研究顯示,抑制致癌基因MYC可以提高黑色素瘤和神經(jīng)母細胞瘤的免疫原性。然而,在LUAD領(lǐng)域,相關(guān)研究仍然缺乏。本研究對LUAD細胞及其MYC擴增表達在腫瘤微環(huán)境(TME)中對免疫細胞的影響進行了探討。首先,本研究對比分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中的LUAD組織樣本和癌旁組織樣本間免疫細胞浸潤差異。研究發(fā)現(xiàn),LUAD組織中CD8+T細胞、CD4+記憶T細胞、NK細胞和M0巨噬細胞的浸潤豐度顯著性降低,而激活Tregs細胞的浸潤豐度顯著提高。在這些免疫細胞中,CD8+T細胞和NK細胞具有直接殺死腫瘤的能力,而CD4+記憶T細胞參與長期免疫應(yīng)答,并且協(xié)助其他免疫細胞(如CD8+T細胞)發(fā)揮抗腫瘤作用［10-13］。然而,在TME中,Tregs細胞通常對腫瘤的增長和擴散具有促進作用［14］。這些研究結(jié)果表明,LUAD細胞能有效地抑制TME中的免疫細胞對其進行的攻擊和持續(xù)免疫反應(yīng)。其次,本研究又進一步在LUAD組織c-MYC高、低表達樣本以及N-MYC高、低表達樣本間進行比較,發(fā)現(xiàn)c-MYC高、低表達樣本間免疫細胞浸潤豐度無差異,而在N-MYC高表達樣本中,CD4+記憶T細胞和激活NK細胞浸潤豐度顯著降低,Tregs細胞浸潤豐度顯著提高。這表明N-MYC基因的過度表達可能會進一步加強LUAD細胞抵抗TME中免疫細胞的攻擊和持久免疫響應(yīng)能力。

鑒于上述N-MYC在TME中的影響,將MYC視為提高LUAD全細胞疫苗免疫原性的潛在靶點具有重要的研究意義。為了對人類LUAD免疫治療提供參考,本研究在小鼠LLC細胞和小鼠模型中進行了相關(guān)全細胞疫苗的實驗研究。

(+)-JQ1和I-BET151是兩種重要的Myc抑制劑,它們聯(lián)合使用會對Myc的抑制作用增強。本研究結(jié)果顯示,(+)-JQ1和I-BET151與LLC細胞共培育4 d后,LLC細胞中c-Myc和N-Myc的表達量顯著下降,并且PD-L1的表達量也顯著下降。PD-L1蛋白位于細胞表面,通過與其受體PD-1結(jié)合,可以抑制免疫細胞的活性,從而阻止其對腫瘤細胞的攻擊。研究表明,約30%～50%的LUAD患者腫瘤細胞中可以檢測到PD-L1的過度表達［15-16］。這表明(+)-JQ1和I-BET151通過靶向抑制Myc使LLC細胞中PD-L1的表達量顯著下降,從而減輕LLC細胞對TME的抑制作用。

目前,制備腫瘤全細胞疫苗的手段主要包括熱滅活和輻射滅活(如使用紫外線、伽馬射線或X射線等輻射源處理腫瘤細胞)［17］。熱滅活法因溫度控制困難導(dǎo)致腫瘤抗原蛋白變性受到限制,而γ或X射線輻射方法受設(shè)備沉重、昂貴的影響,也限制了其廣泛應(yīng)用。盡管紫外線設(shè)備輕便且廉價,但透射性差限制了其使用。本研究通過設(shè)定1×1010/L細胞懸液濃度、1 mm高度并在搖床上以50 r/min搖晃,并進行15 min的紫外線照射后,成功制備出LLC全細胞疫苗。采用這種方法制備的全細胞疫苗能夠最大限度地保留LLC細胞表面的腫瘤抗原及其免疫原性。

然后,本研究在小鼠模型中評估了針對Myc靶向抑制的LLC全細胞疫苗抵抗LLC的效果。相比接種無抑制劑處理的LLC全細胞疫苗,接種抑制劑處理的LLC全細胞疫苗可以使小鼠腫瘤增長明顯減緩,生存期也得到顯著提高。并且,接種抑制劑處理的LLC疫苗后小鼠脾臟和腫瘤內(nèi)CD3+CD8+/CD3+T細胞比值以及血清TNF-α、IFN-γ表達水平均有顯著提高。CD3+CD8+T細胞是細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)的主要成分,在免疫監(jiān)視過程中起到關(guān)鍵作用。CD3+CD8+T細胞能夠識別腫瘤細胞表面的特異性抗原并結(jié)合,激活CTLs,進而釋放細胞毒性分子如穿孔素和顆粒酶B,導(dǎo)致腫瘤細胞的凋亡［18］。此外,CD3+CD8+T細胞還能分泌細胞因子如TNF-α和IFN-γ,進一步增強免疫系統(tǒng)對腫瘤的攻擊能力［19］。TNF-α和IFN-γ由免疫系統(tǒng)的細胞(如巨噬細胞、樹突狀細胞、NK細胞等)分泌產(chǎn)生,通過直接殺傷腫瘤細胞、抑制腫瘤細胞生長、抗血管生成以及調(diào)節(jié)免疫細胞活性等作用共同促使免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的清除。這些研究結(jié)果均表明,通過抑制Myc,能夠顯著增強LLC全細胞疫苗對免疫系統(tǒng)的激活作用,進而提升免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的殺傷能力。

綜上所述,本研究成功制備了針對Myc靶向抑制的LLC全細胞疫苗。在小鼠模型中,接種這種LLC全細胞疫苗可以增強免疫系統(tǒng)對LLC的攻擊能力,從而顯著減緩腫瘤的生長速度,延長小鼠的生存期。這一發(fā)現(xiàn)為應(yīng)用全細胞疫苗治療人LUAD提供了數(shù)據(jù)參考。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學(xué)實驗動物福利倫理委員會的審核批準(文件號20220405C5718-202206097)。所有實驗過程均遵照《實驗動物管理條例》規(guī)定進行。

作者聲明：所有作者參與了研究設(shè)計及論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文,且均聲明不存在利益沖突。