尤紅娟 李筱媛 韓亞斐 周泉 陳雪紅 呂秋蘭 姚如永

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)藥理學(xué)系,山東 青島 266071; 2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)科; 3 青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心)

酒精性肝損傷(alcoholic liver disease,ALD)又稱酒精性肝病,包括酒精性脂肪肝、肝炎、肝纖維化等［1］。近年來ALD病死率逐年升高,成為世界范圍內(nèi)關(guān)注的熱點［2］。以往研究表明酒精導(dǎo)致的腸道菌群變化是誘發(fā)ALD的主要機制之一,在疾病發(fā)展中起到重要促進作用［3-4］,但目前ALD尚無針對性的治療措施,亟需尋找防治ALD的新方案。

四君子湯源于《太平惠民和劑局方》,主要由人參、白術(shù)以及茯苓和甘草組成,具有益氣健脾之功效［5］。研究發(fā)現(xiàn)四君子湯能夠調(diào)節(jié)腸道菌群、提高腸道的免疫功能［6］,但其對ALD的防治作用尚未見相關(guān)報道。傳統(tǒng)中醫(yī)認為“肝病當先實脾”,脾氣旺盛,肝疾可愈［7］。本研究基于“實脾治肝”思路,探討四君子湯調(diào)節(jié)腸道菌群治療ALD的療效,為四君子湯治療酒精性肝病提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠32只,體質(zhì)量19～21 g,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)于青島大學(xué)附屬醫(yī)院SPF級實驗動物中心,環(huán)境溫度(20±2)℃左右,相對濕度(50±10)%,12-12 h晝夜周期。

1.2 主要試劑與藥品

中藥人參、茯苓、白術(shù)以及甘草購買于青島大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科(批號:SYKGQDYXGS,上藥控股青島有限公司);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、總膽紅素(T-BIL)和堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒購自深圳市邁瑞生物醫(yī)藥電子有限公司;體積分數(shù)0.56的乙醇溶液購自北京紅星股份有限公司。

1.3 中藥制備

將人參、茯苓、白術(shù)、甘草(配制比例9∶9∶9∶6)放入陶瓷鍋中,用700 mL蒸餾水浸泡 1 h,武火煮沸后,改用文火熬制40 min,隨后用三層紗布過濾,重復(fù)煎煮2次。然后合并水煎液,再用文火濃縮成1.0 g/mL,4 ℃下保存,使用時加熱至37 ℃。

1.4 動物分組及處理

C57BL/6小鼠隨機分為正常組(A組)、酒精模型組(B組)、四君子湯低劑量組(C組)和四君子湯高劑量組(D組),每組8只。各組小鼠自由進食飲水,適應(yīng)環(huán)境1周后進行實驗。每天8:00,B～D組小鼠灌胃體積分數(shù)0.56的乙醇溶液(6 g/kg),A組小鼠灌胃等劑量的生理鹽水,同日17:00,C、D組小鼠分別灌胃5、10 g/kg的四君子湯,A、B組小鼠灌胃等劑量生理鹽水。連續(xù)灌胃18 d,觀察小鼠狀態(tài),每5 d記錄一次小鼠體質(zhì)量和攝食量。

灌胃結(jié)束后,無菌收集新鮮糞便,備用。隨后所有小鼠禁食5 h,灌胃10 μL/g異硫氰酸熒光素-葡聚糖(FD-4,50 g/L,相對分子質(zhì)量為4 400,Sigma-Aldrich),3.5 h以后各組小鼠使用異氟烷麻醉,眼眥取血200 μL,備用。1 d后麻醉各組小鼠并摘取眼球取血,備用;斷頸處死并快速解剖小鼠肝臟、脾臟備用。

1.5 小鼠肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)測定

準確稱量各組小鼠肝臟、脾臟質(zhì)量,計算肝指數(shù)以及脾指數(shù),肝指數(shù)=肝臟濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%,脾指數(shù)=脾臟濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.6 小鼠血清生化指標檢測

取各組小鼠眼球所取血液,分離血清,并使用全自動生化分析儀檢測小鼠血清當中的ALT、AST、ALP、T-BIL、TG、TC水平。

1.7 小鼠肝臟和脾臟組織病理學(xué)分析

取各組小鼠肝臟和脾臟組織,用40 g/L多聚甲醛溶液固定,常規(guī)切片,按試劑盒說明書對脾臟和部分肝臟切片行蘇木精-伊紅(HE)染色,另一部分肝臟切片行油紅O染色,光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.8 小鼠腸道通透性檢測

取各組小鼠眼眥所取血液200 μL,分離血清,以生理鹽水按照1∶2比例稀釋以后,在激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長528 nm下采用熒光分光光度計測量熒光強度。根據(jù)標準曲線,測定血液中FD-4的濃度,依據(jù)FD-4濃度變化反應(yīng)腸道通透性。

1.9 腸道菌群分析

從每組中隨機選取5例糞便樣本,交由上海美吉生物進行16S rDNA中v3～v4區(qū)域高通量測序分析。對測序結(jié)果優(yōu)化處理后按照97%相似性進行操作分類單元(OTU)聚類。根據(jù)OTU豐度,用Mothur計算隨機抽樣下Sobs、Shannon、Coverage指數(shù),利用R語言工具繪制稀釋曲線,反映樣本測序數(shù)據(jù)量是否合理;使用Mothur軟件進行α多樣性分析,得到代表物種豐富度的指標Chao和代表物種多樣性的指標Shannon;使用QIIME軟件和R語言進行β多樣性中PCoA分析并繪圖。根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果,運用R語言工具對不同分組在門、屬水平上物種組成和相對豐度進行綜合性分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 四君子湯對小鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)以及脾指數(shù)的影響

灌胃結(jié)束時,A組小鼠毛色黑亮,精神抖擻,行動敏捷;B組小鼠毛色暗淡發(fā)灰,精神萎靡,食欲不振;C、D組小鼠毛色鮮亮,精神狀態(tài)、行動力正常。各組小鼠體質(zhì)量比較差異有顯著性(F=8.41,P<0.05),其中B組與A、D組比較體質(zhì)量顯著性降低(t=3.38、4.02,P<0.05),C組與B組體質(zhì)量比較,差異無顯著性(P>0.05);各組小鼠的肝指數(shù)、脾指數(shù)比較差異均有顯著性(F=5.38、4.72,P<0.05),其中B組與A、D組比較小鼠的肝指數(shù)、脾指數(shù)顯著升高(t=2.72～4.58,P<0.05),而C組與B組比較肝指數(shù)、脾指數(shù)差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 四君子湯對小鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)以及脾指數(shù)的影響

2.2 四君子湯對小鼠肝功能和血脂的影響

各組小鼠血清中ALT、AST、ALP、T-BIL、TG和TC水平比較差異具有顯著性(F=9.43～36.42,P<0.05),其中B組與A、C、D組比較小鼠血清中ALT、AST、TC水平顯著增加(t=2.19～7.62,P<0.05);B組與A、D組相比較,小鼠血清中的ALP、T-BIL、TG水平均顯著性升高(t=3.51～5.94,P<0.05),而C組與B組相比較,小鼠血清中的ALP、T-BIL、TG水平降低,差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 四君子湯對ALD小鼠肝功能和血脂指標的影響

2.3 四君子湯對小鼠肝脾形態(tài)的影響

脾臟組織HE染色結(jié)果見圖1a,A組小鼠脾細胞結(jié)構(gòu)完好,紅髓白髓界限清晰,無明顯病理形態(tài)改變;B組小鼠脾細胞結(jié)構(gòu)崩解,大量細胞溶解壞死(箭頭示);C組小鼠脾細胞結(jié)構(gòu)趨于正常,但紅髓白髓界限處有細胞溶解(箭頭示);D組小鼠脾細胞結(jié)構(gòu)、紅髓白髓趨于正常,界限清晰,與A組比較無明顯差異。

肝臟組織HE染色結(jié)果見圖1b,A組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整,肝索排列整齊,未見明顯異常;B組小鼠肝索結(jié)構(gòu)紊亂,大量肝細胞氣球樣變,胞質(zhì)空泡化(箭頭示);C、D組小鼠肝索排列趨于正常,肝細胞脂肪變性明顯減輕,其中A、D組形態(tài)接近一致。

肝臟組織油紅O染色結(jié)果見圖1c,A組小鼠肝臟無明顯異常;B組小鼠肝臟中脂滴增大,數(shù)量增多,脂肪蓄積嚴重(箭頭示);C組小鼠肝臟脂肪蓄積情況明顯減輕(箭頭示);D組小鼠肝臟無明顯脂肪蓄積,與A組小鼠的肝臟組織幾乎一致。

2.4 四君子湯對小鼠的腸道通透性的影響

A～D組小鼠的血清當中FD-4的濃度分別達到(0.21±0.04)、(0.59±0.31)、(0.44±0.19)、(0.24±0.06)mg/L;各組間比較差異具有顯著性(F=7.61,P<0.05),其中B組與A、D組比較,小鼠的腸道通透性顯著增高(t=3.50、3.19,P<0.05),C組與B組小鼠的腸道通透性進行比較,差異均無顯著意義(P>0.05)。

2.5 四君子湯對小鼠腸道菌群多樣性的影響

本研究基于Sobs指數(shù)的稀釋曲線趨于平坦(圖2a),說明本次測序數(shù)據(jù)量合理;基于Shannon指數(shù)的稀釋曲線趨于平坦(圖2b),說明本次測序數(shù)據(jù)量足夠大;基于Coverage指數(shù)的稀釋曲線顯示整體Coverage值趨近于1(圖2c),說明測序深度良好,整體覆蓋率較高,能真實反映樣品中的微生物群落狀況。綜合以上結(jié)果,本次測序數(shù)據(jù)合理,可用于后續(xù)的多樣性分析。

a:基于Sobs指數(shù)的稀釋曲線,b:基于Shannon指數(shù)的稀釋曲線,c:腸道功群基于Coverage指數(shù)的稀釋曲線

小鼠腸道菌群α多樣性分析顯示,各組小鼠腸道菌群Chao指數(shù)比較差異無顯著性(P>0.05),見圖3a;各組小鼠Shannon指數(shù)比較差異具有顯著性(F=7.26,P<0.05),其中C、D組與B組進行比較,Shannon指數(shù)均顯著性增高(t=4.33、4.85,P<0.05),見圖3b。

a:基于Chao指數(shù)的α多樣性分析,b:基于Shannon指數(shù)的α多樣性,c:腸道菌群β多樣性中PCoA分析

小鼠腸道菌群β多樣性中PCoA分析顯示,各組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)比較差異有顯著性(R=0.29,P<0.05),其中B與A、C、D組完全分開,說明群落結(jié)構(gòu)差異較大(P<0.05),A組與C、D組有重疊且距離較近,說明物種組成結(jié)構(gòu)相似,見圖3c。

2.6 四君子湯對小鼠腸道菌群物種組成的影響

小鼠腸道菌群門水平上物種分析顯示,各組小鼠的腸道菌群主要由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、彎曲菌門(Campilobacterota)以及放線菌門(Actinobacteriota)等組成,其中厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度最高,約占90%。B組與A組比較,厚壁菌門相對豐度下降了9.22%,擬桿菌門相對豐度增加了12.11%,厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)下降了49.73%;D組與B組比較,厚壁菌門相對豐度增加了1.01%,擬桿菌門相對豐度降低了1.00%,F/B比值增加了3.69%。而C組與B組比較,厚壁菌門相對豐度增加了0.94%,擬桿菌門相對豐度增加了1.00%,F/B比值無明顯變化,見圖4a。小鼠腸道菌群屬水平檢測顯示,B組與A組比較,Prevotellaceae_UCG-001、Alloprevotella、norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014等相對豐度增加,但是Allobaculum、Dubosiella、Bifidobacterium、norank_f_Lachnospiraceae等的相對豐度降低;C、D組較B組,Prevotellaceae_UCG-001、Alloprevotella、norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014等菌屬含量降低,但是Dubosiella、Bifidobacterium、Allobaculum、norank_f_Lachnospiraceae等有益菌屬含量增加,且D組病原菌降低以及益生菌增加更明顯,見圖4b。

a:小鼠腸道菌群門水平上物種組成和相對豐度柱狀圖,b:小鼠腸道菌群屬水平上物種組成和相對豐度柱狀圖

3 討 論

歷代醫(yī)者認為,酒屬濕熱毒,酗酒則傷及脾、胃、肝、腸等,造成肝氣郁結(jié),脾胃虛弱,氣血不和,生痰積熱。肝脾腸三臟俱損是ALD的重要病機,健脾是疏肝的重要途徑［8］。ALD發(fā)病機制之一是酗酒導(dǎo)致腸道微生物變化,與中醫(yī)酒濕傷脾有異曲同工之處［9］。四君子湯是健脾祛濕的代表方劑,其調(diào)節(jié)腸道菌群的作用［10］,可能有助于防治ALD。本研究通過建立小鼠ALD模型,圍繞腸道菌群變化探討四君子湯對小鼠ALD的防治作用。

體質(zhì)量和臟器指數(shù)是反映身體健康狀況的指標之一［11］,而肝臟和脾臟的病理檢查是反映肝脾細胞損傷程度的最直觀的證據(jù),也是臨床診斷常用的金標準［12］。此外血清中ALT、AST、ALP、T-BIL水平反映肝損傷程度,TG和TC水平反映脂質(zhì)堆積情況。當肝臟受到酒精、病毒等因素刺激后,ALT和AST會大量釋放至血液中［13］。本研究發(fā)現(xiàn),酗酒可導(dǎo)致小鼠肝脾臟器腫大,體質(zhì)量顯著下降而肝脾指數(shù)明顯升高;同時,B組與A組相比較,血清中ALT、AST、ALP、T-BIL、TG、TC水平顯著升高。HE染色結(jié)果顯示,B組小鼠肝臟損傷最為嚴重,出現(xiàn)肝索結(jié)構(gòu)紊亂,肝細胞氣球樣變,脾組織細胞結(jié)構(gòu)崩解壞死。油紅O染色顯示,B組小鼠肝臟內(nèi)呈現(xiàn)油紅O著色,提示肝臟脂肪蓄積和脂肪變性情況嚴重。而四君子湯的干預(yù)可增加小鼠的體質(zhì)量,降低肝脾指數(shù),降低血清中的ALT、AST、ALP、T-BIL、TG、TC水平,改善肝臟脾臟的病理損傷。表明四君子湯可以對小鼠ALD起到了一定的防治作用。

大量研究證實腸道微生物與ALD發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［14］。由于酒精攝入引起腸道菌群失調(diào),進而導(dǎo)致腸道黏膜屏障受損,腸道通透性增加,從而影響肝臟功能［15］。本研究通過檢測腸道通透性以及腸道菌群變化,來進一步判斷四君子湯是否是通過該途徑改善肝臟損傷。本研究發(fā)現(xiàn)B組與A組比較,小鼠腸道通透性顯著增高,與WANG等［16］研究結(jié)果類似;而C、D組與B組比較腸道通透性明顯改善。腸道菌群的檢測結(jié)果也顯示B組小鼠腸道菌群α多樣性明顯低于A組,與FAN等［17］研究結(jié)果相似;C、D組菌群多樣性以及豐富度高于B組。本研究腸道菌群β多樣性分析結(jié)果表明,C、D組腸道微生物分布與A組相似度高,且均與B組差異較大,與LENG等［18］研究結(jié)果一致。酒精及其代謝產(chǎn)物會影響腸道菌群組成,導(dǎo)致菌群失調(diào)［19］。本研究發(fā)現(xiàn),B組較A組在腸道菌群門水平上可使擬桿菌門相對豐度升高,厚壁菌門相對豐度降低,厚壁菌門與擬桿菌門比值降低,與LIU等［20］結(jié)果類似;在屬水平上,酒精過量攝入使B組中Prevotellaceae_UCG-001、Alloprevotella等菌屬顯著富集但是Allobaculum、Dubosiella、Bifidobacterium的相對豐度降低。其中Prevotella_UCG-001是機會性致病菌,與腸炎、肝炎及代謝紊亂等疾病相關(guān)［21］。Alloprevotella屬于革蘭陰性桿菌,與牙周炎、直腸炎等多種疾病相關(guān)［22-24］。在給予四君子湯后,腸道微生物變化明顯。D組小鼠腸道菌群門水平上較B組擬桿菌門豐度降低,F/B比值增加;C組較B組厚壁菌門豐度升高,而擬桿菌門也升高,具體機制尚需進一步探討。小鼠腸道菌群屬水平上C、D組較B組Prevotellaceae_UCG-001、Alloprevotella菌屬含量降低,推測四君子湯具有緩解腸道炎癥的潛在益處;而Dubosiella、Bifidobacterium、Allobaculum等有益菌屬含量增加;其中D組致病菌降低以及有益菌升高更為顯著。Dubosiella具有參與調(diào)節(jié)身體代謝、提高腸道免疫力、改善肥胖癥狀以及改善酒精性肝損傷等作用［25］。Bifidobacterium在調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、限制腸道潛在致病菌黏附和過度生長、改善腸黏膜屏障功能等方面均能夠發(fā)揮重要作用［26］。Allobaculum作為短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌在改善腸屏障的完整性方面起著重要作用［27］。本研究結(jié)果表明,四君子湯通過改善腸黏膜屏障,降低腸道通透性,調(diào)節(jié)菌群多樣性,增加Dubosiella、Bifidobacterium、Allobaculum等有益菌,減少致病菌,從而改善酒精性肝損傷,符合“肝病要實脾”的理念。

總之,本研究顯示,四君子湯可有效改善酒精誘導(dǎo)的肝損傷,其作用機制包括改善肝功能、調(diào)節(jié)脂類代謝、改善腸道黏膜屏障,增加腸道菌群多樣性、提高Dubosiella、Bifidobacterium、Allobaculum等有益菌含量等多種途徑,具有顯著的多途徑、多效應(yīng)優(yōu)勢。本研究圍繞腸道菌群變化,揭示四君子湯通過“實脾”達到“治肝”的作用,為探索中藥方劑對酒精性肝病的防治提供了新思路。

倫理批準和動物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已經(jīng)通過了青島大學(xué)附屬醫(yī)院實驗動物福利倫理委員會的審核批準(文件號AHQU-MA-L20200626)。所有實驗過程均遵照《實驗動物管理條例》進行。

作者聲明：尤紅娟、韓亞斐、周泉、呂秋蘭參與了研究設(shè)計;李筱媛、陳雪紅、姚如永、尤紅娟參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文,且均聲明不存在利益沖突。