李慎風 莊曌 刁玉晶 曹宏 王壽世

(青島大學附屬青島市中心醫(yī)院麻醉與圍術期醫(yī)學科,山東 青島 266042)

丙泊酚因為麻醉起效快、患者蘇醒迅速及副作用少而在臨床上被廣泛使用［1］。近年來,研究表明,長期或多次使用丙泊酚,特別是對發(fā)育期動物,具有誘發(fā)嚴重的神經(jīng)毒性并影響其大腦發(fā)育的可能［2-3］。2016年12月美國食品和藥物管理局發(fā)布警告稱,孕晚期的孕婦以及3歲以下兒童長時間(超過3 h)或頻繁使用全身麻醉藥,可能導致胎兒或兒童腦發(fā)育異常,批準丙泊酚僅用于≥2個月兒童的麻醉維持和≥3歲兒童的麻醉誘導［4］。但目前關于丙泊酚致神經(jīng)毒性的具體機制并不完全明確。本研究通過代謝組學和轉錄組學聯(lián)合分析,篩選丙泊酚致神經(jīng)毒性的關鍵基因,為后續(xù)丙泊酚致神經(jīng)毒性的分子機制研究提供理論基礎,也為丙泊酚的神經(jīng)毒性預防用藥和治療用藥的開發(fā)提供研究方向。

1 材料和方法

1.1 不同濃度丙泊酚對HT22細胞活性的影響

將小鼠海馬神經(jīng)細胞HT22細胞(上海雅吉生物科技有限公司)放置于含體積分數(shù)0.10的FBS和100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM中, 37 ℃下于含體積分數(shù)0.05的CO2環(huán)境中進行培養(yǎng)。當細胞密度達80%～90%時接種于96孔板中,每孔約5 000個細胞。培養(yǎng)24 h細胞貼壁后,棄去原培養(yǎng)液,分別加入含有0、25、50、75、100 mg/L丙泊酚(Ctrl組、P25組、P50組、P75組、P100組)的DMEM。丙泊酚貨號:KM7Q-3CMN。每個濃度設置3個復孔,同時再設置一組無細胞孔板作為空白組。將各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h,換液為含有10%的CCK-8溶液培養(yǎng)基,37 ℃下孵育2.5 h,用酶標儀檢測波長450 nm處各孔吸光度值,以吸光度值表示細胞活性。細胞活性=(實驗組吸光度值-空白組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白組吸光度值)×100%。

1.2 各組HT22細胞中代謝物和RNA的提取

將HT22細胞接種于直徑10 cm細胞培養(yǎng)皿中,使用含有體積分數(shù)0.10的FBS和100 kU/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,37 ℃下于含體積分數(shù)0.05 CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞密度達到60%～70%時,棄去原培養(yǎng)基,更換為含不同濃度丙泊酚(Ctrl組、P25組、P50組、P75組、P100組)的新鮮DMEM培養(yǎng)基。移入培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實驗重復3次,收集3次實驗的HT22細胞樣本,轉移至1.5 mL EP管中,-80 ℃冰箱保存。委托廣州基迪奧生物技術有限公司提取各組細胞樣本中的代謝物和RNA,用于后續(xù)分析。

1.3 各組HT22細胞中代謝物的代謝組學分析

1.3.1液相色譜-質譜(LC-MS)分析 使用QTOF/MS-6550質譜儀(美國Aglient公司)、1290 Infinity LC超高效液相色譜儀(美國Aglient公司)對各組HT22細胞中提取出的代謝物進行檢測。使用Proteo Wizard軟件對LC-MS檢測到的代謝物的種類和數(shù)量進行分析,結果以環(huán)形圖表示。

1.3.2差異代謝物分析 使用R軟件的limma包對各組HT22細胞代謝物進行差異代謝物分析,獲得差異代謝物的種類和數(shù)量,繪制火山圖。

1.3.3代謝物含量的趨勢分析 使用OmicShare Tools (https://www.omicshare.com/tools)對各組HT22細胞代謝物含量進行趨勢分析。獲得同趨勢代謝物,即各濃度組與Ctrl組相比,細胞代謝物均有上升趨勢或均有下降趨勢的代謝物。將差異代謝物和同趨勢代謝物取交集,得到關鍵代謝物。

1.4 各組HT22細胞RNA的轉錄組學分析

1.4.1序列比對分析 對提取出的各組HT22細胞中的RNA構建cDNA文庫,使用Illumina HiSeq Xten高通量測序儀上機測序。使用HISAT2軟件以小鼠基因組作為參考系,進行測序序列比對分析,獲得各組HT22細胞中的測序序列數(shù)量,并計算總映射(定位到基因組上全部的序列數(shù)占有效序列)及其百分比和多個映射(在參考序列上有多個比對位置的序列)及其百分比。

1.4.2差異基因分析 使用Stringtie重構轉錄本,對基因表達水平進行定量分析。基于各組HT22細胞中基因表達量,使用R軟件的limma包分析獲得各濃度組與Ctrl組的差異基因,并繪制火山圖。

1.5 代謝組學和轉錄組學的聯(lián)合分析

1.5.1加權基因共表達分析(WGCNA) 將小鼠基因組按照基因表達相似性分為29個模塊,同一模塊內的基因表達相似性接近。使用R軟件的WGCNA包以小鼠基因組為參考系,以關鍵代謝物的二級分類為表型,使用Pearson相關分析探究小鼠基因組各模塊和HT22細胞關鍵代謝物之間的相關性,以聚類熱圖形式表示。提取與關鍵代謝物有顯著相關的小鼠基因組模塊中全部基因,即相關基因。

1.5.2蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡(PPI)分析 使用R軟件將上面WGCNA分析獲得的相關基因與轉錄組學分析獲得的差異基因取交集,得到差異相關基因。為了解基因之間的功能關系,將差異相關基因所編碼的蛋白通過STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)和Cytoscape軟件(3.4.0版)進行PPI可視化分析,篩選出基因功能關系密切的關鍵基因。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 9.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,呈正態(tài)分布的計量資料兩組簡單比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用Bonferroni方法,以P<0.05為有統(tǒng)計學意義?；蚣按x物表達量的計算采用FPKM法。采用R軟件的limma包進行兩組間代謝物含量和基因表達水平差異分析,將錯誤發(fā)現(xiàn)率P<0.05和差異倍數(shù)絕對值(|Fold Change|)≥1作為差異代謝物和差異基因的篩選標準。

2 結 果

2.1 各組HT22細胞活性比較

Ctrl組、P25組、P50組、P75組、P100組HT22細胞的活性分別達到(100.70±1.25)%、(81.36±1.43)%、(70.76±1.27)%、(30.37±0.72)%、(10.27±0.86)%,各組間比較差異有顯著性(F=3 221.00,P<0.05),進一步行各組間HT22細胞活性兩兩比較,差異均具有顯著性,并呈現(xiàn)劑量依賴性下降(t=11.40～97.25,P<0.05)。

2.2 各組HT22細胞中代謝物的代謝組學分析

2.2.1LC-MS分析 LC-MS分析結果顯示,從各組HT22細胞代謝物中共檢測到2 701種代謝物,其中屬于二級分類的有620種,一級分類的有23種,占比最多的是苯及其取代衍生物,見圖1。環(huán)形圖中不同顏色代表不同代謝物一級分類,色塊長度表示其所占比例;Class代表所檢測到的代謝物的一級分類。

圖1 代謝物種類和數(shù)量的環(huán)形圖

2.2.2差異代謝物分析 Ctrl組與P25組間的差異代謝物共有9個,其中上調的2個,下調的7個(圖2A);Ctrl組與P50組間的差異代謝物共有21個,其中上調的6個,下調的15個(圖2B);Ctrl組與P75組間的差異代謝物共有27個,其中上調的6個,下調的21個(圖2C);Ctrl組與P100組間的差異代謝物共有67個,其中上調的55個,下調的12個(圖2D)。

A、B、C、D分別為Ctrl組與P25組、P50組、P75組、P100組的差異代謝物分析;綠色表示下調,灰色表示無統(tǒng)計學差異,紅色表示上調

2.2.3趨勢分析 各濃度組與Ctrl組相比,隨丙泊酚濃度升高均持續(xù)上升的代謝物共有208種,沒有發(fā)現(xiàn)隨丙泊酚濃度升高均持續(xù)下降的代謝物。與上面獲得的所有差異代謝物取交集,共得到49種關鍵代謝物。

2.3 各組HT22細胞中RNA的轉錄組學分析

2.3.1序列比對分析 RNA序列比對分析結果示,Ctrl組、P25組、P50組、P75組及P100組總有效序列數(shù)分別為46 308 970、42 145 574、39 362 782、45 367 077、46 692 981;總映射及其百分比分別為42 232 951(91.20%)、39 633 550(94.04%)、35 152 896(89.30%)、42 430 229(93.53%)、44 139 716(94.53%),多個映射及其百分比分別為3 537 096(7.64%)、2 459 613(5.84%)、3 369 032(8.56%)、2 685 366(5.92%)、2 271 619(4.86%)。各組總映射百分比>70%,多個映射百分比均<10%,說明各組HT22細胞的測序序列數(shù)量符合要求,能夠滿足數(shù)據(jù)分析需要。

2.3.2差異基因分析 Ctrl組與P25組的差異基因共有1 254個,其中上調的1 130個,下調的124個(圖3A);Ctrl組與P50組的差異基因共有4 695個,其中上調的2 544個,下調的2 151個(圖3B);Ctrl組與P75組的差異基因共有4 923個,其中上調的2 324個,下調的2 599個(圖3C);Ctrl組與P100組間的差異基因共有5 031個,其中上調的2 704個,下調的2 327個(圖3D)。

A、B、C、D分別為Ctrl組與P25、P50組、P75組、P100組的差異基因分析;紅色表示上調,藍色表示下調

2.4 代謝組學和轉錄組學聯(lián)合分析

2.4.1小鼠基因組和HT22細胞關鍵代謝物的WGCNA分析 WGCNA分析結果顯示,小鼠的基因組模塊當中navajowhite2、darkolivegreen模塊與HT22細胞關鍵代謝物呈正相關,floralwhite、white模塊與HT22細胞關鍵代謝物呈負相關(圖4)。上面4個小鼠基因組模塊當中共包含有5 698個相關基因。

橫坐標代表HT22細胞代謝物的2級分類,縱坐標為小鼠基因組的29個模塊;圖中的括號外數(shù)值代表Pearson相關系數(shù),絕對值越接近1代表相關性越強;括號內數(shù)值代表P值,P<0.05有統(tǒng)計學差異。紅色代表模塊基因與各類代謝物呈正相關,藍色代表各類模塊基因與代謝物呈負相關

2.4.2差異相關基因的PPI分析 相關基因與所有差異基因取交集,共得到88個差異相關基因。PPI分析結果顯示,有15種蛋白之間關系密切,其所對應的基因分別為NTNG2、ENG、SEMA4G、JAG2、FGF11、SERPINE1、GDF15、GADD45G、F3、NGF、FGF21、PGF、EGFL7、SEMA6D、LRFN1,即為關鍵基因。

3 討 論

丙泊酚已有30余年的臨床應用史,目前是臨床中最常用的靜脈麻醉藥物,主要用于患者的麻醉誘導和維持。然而丙泊酚應用于患兒時,對處于發(fā)育期患兒大腦的安全性一直存在爭議［5］。近年多項研究表明丙泊酚對嚙齒類、斑馬魚、恒河猴等發(fā)育期動物可產(chǎn)生神經(jīng)毒性,導致神經(jīng)元死亡和長期的神經(jīng)行為損傷［3,6-7］。然而關于丙泊酚致神經(jīng)毒性的關鍵基因以及分子機制尚不明確,因此了解丙泊酚致神經(jīng)毒性的關鍵基因及其相關分子機制至關重要。

本研究中CCK-8實驗檢測結果顯示,隨丙泊酚濃度升高,HT22細胞活性顯著下降,提示丙泊酚對HT22細胞存在神經(jīng)毒性,且其毒性作用隨丙泊酚濃度的升高而升高。對不同濃度丙泊酚處理HT22細胞24 h后,提取各組細胞中的代謝物進行代謝組學分析,LC-MS分析顯示,共檢測到2 701種代謝物;進一步對這2 701種代謝物進行各組間差異分析和趨勢分析,最終獲得了49種關鍵代謝物。對不同濃度丙泊酚處理HT22細胞24 h后,提取細胞中的RNA進行轉錄組學分析,獲得Ctrl組和各濃度組之間的差異基因。最后進行代謝組學和轉錄組學的聯(lián)合分析,以小鼠基因組為參考系,以關鍵代謝物為表型,進行WGCNA分析,篩選出相關基因;將差異基因與相關基因取交集,得到88個差異相關基因。為進一步了解基因之間功能聯(lián)系,篩選出關鍵基因,對這88個基因所編碼的蛋白進行PPI分析,發(fā)現(xiàn)15個基因(NTNG2、ENG、SEMA4G、JAG2、FGF11、SERPINE1、GDF15、GADD45G、F3、NGF、FGF21、PGF、EGFL7、SEMA6D、LRFN1)所編碼蛋白之間關系密切,即為本研究最終獲得的關鍵基因。

NGF對神經(jīng)元的發(fā)育、分化和存活起著關鍵作用。為了探索NGF在丙泊酚致神經(jīng)毒性中的作用,研究發(fā)現(xiàn),NGF可通過Rac1信號通路對體外培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)元發(fā)揮神經(jīng)保護作用,從而減輕丙泊酚誘導的海馬神經(jīng)元凋亡［8］。NTNG2編碼膜錨定蛋白netrin-G2,敲低小鼠NTNG2基因會導致小鼠神經(jīng)元形態(tài)嚴重受損以及皮質神經(jīng)元遷移障礙［9］,使小鼠在學習、記憶、視覺和運動功能方面存在明顯缺陷［10］。FGF11屬于成纖維細胞生長因子信號蛋白家族,可能參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能的維持［11-12］。研究顯示,在有機磷導致的中國珍稀米諾魚的神經(jīng)毒性研究中,FGF11發(fā)揮了重要作用［13］。F3是一種糖基磷脂酰肌醇錨定的糖蛋白,參與神經(jīng)元發(fā)育、突觸維持和神經(jīng)元網(wǎng)絡的形成,可能影響神經(jīng)元凋亡和β-淀粉樣蛋白(Aβ)的產(chǎn)生［14］。EGFL7是表皮生長因子樣蛋白家族的成員,在神經(jīng)系統(tǒng)中,EGFL7通過Notch通路促進神經(jīng)干細胞形成神經(jīng)元［15］。用分泌EGFL7的間充質干細胞治療新生小鼠缺血缺氧性腦損傷,能夠改善其運動功能［16］。SERPINE1是纖溶酶原激活抑制劑,能夠阻斷纖溶酶原向纖溶酶的轉化,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對于神經(jīng)元的遷移、成熟突觸的連接等過程起著重要作用［17］。纖維蛋白溶解系統(tǒng)能夠調節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內的炎癥和退行性事件。小鼠大腦中長期升高的SERPINE1水平可能通過抑制纖溶酶依賴性的Aβ的降解,引起Aβ的累積,進而促進其阿爾茲海默癥的進展［18］。GDF15是轉化生長因子-β超家族的一員,研究證明GDF15可通過p62-Keap1-Nrf2信號通路抑制脊髓損傷后神經(jīng)元氧化應激依賴性鐵死亡,減輕神經(jīng)損傷,從而促進脊髓損傷小鼠運動功能恢復［19］。FGF21能夠通過其多種代謝調節(jié)作用和抗炎作用改善肥胖誘導的小鼠認知功能障礙和焦慮樣行為［20］。PGF是一種血管生成因子,在病理條件下可發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護的作用［21］。以上的研究均表明,NTNG2、FGF11、F3、EGFL7、SERPINE1、GDF15、FGF21、PGF基因均在神經(jīng)損傷的過程中發(fā)揮著重要作用,但這些基因在丙泊酚致神經(jīng)毒性的研究中尚未見相關報道,結合本研究的篩選結果,它們可能是丙泊酚致神經(jīng)毒性的關鍵基因。

除此之外,既往的研究發(fā)現(xiàn),SEMA4G、JAG2、GADD45G、SEMA6D、LRFN、ENG基因在軸突引導［22-23］、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育［24-25］、新皮質形成［26］等過程中均發(fā)揮重要作用,但尚未見這些基因與神經(jīng)毒性或者神經(jīng)損傷有關聯(lián)的報道,結合本研究的篩選結果,這些基因可能是丙泊酚導致神經(jīng)毒性的潛在靶點。

綜上所述,通過代謝組學和轉錄組學聯(lián)合分析,丙泊酚致神經(jīng)毒性的關鍵基因為NTNG2、ENG、SEMA4G、JAG2、FGF11、SERPINE1、GDF15、GADD45G、F3、NGF、FGF21、PGF、EGFL7、SEMA6D、LRFN1,為后續(xù)丙泊酚致神經(jīng)毒性的分子機制研究提供了理論基礎,同時也為丙泊酚的神經(jīng)毒性預防和治療用藥的開發(fā)提供了研究方向。

作者聲明：李慎風、莊曌參與了研究設計;李慎風、王壽世、刁玉晶、曹宏參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文,且均聲明不存在利益沖突。