李笑妍 周筱慧 董河 董銘心

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科,山東 青島 266075; 2 青島大學(xué)藥學(xué)院)

嗎啡作為經(jīng)典的阿片類鎮(zhèn)痛藥物在臨床中應(yīng)用廣泛,具有強(qiáng)效鎮(zhèn)痛作用［1］。然而嗎啡在發(fā)揮強(qiáng)大鎮(zhèn)痛作用的同時(shí),也會(huì)產(chǎn)生藥物耐受、呼吸抑制、便秘、成癮等副作用,極大地限制了其臨床使用［2-4］。因此,如何在使用嗎啡鎮(zhèn)痛時(shí)盡可能減少其副作用發(fā)生,成為目前學(xué)界研究的重點(diǎn)問題。既往研究發(fā)現(xiàn)嗎啡主要通過激活μ阿片受體(MOR)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用,但是此過程也導(dǎo)致了嗎啡的副作用［5］。MOR羧基端包含了11個(gè)絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)的關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn),當(dāng)阿片類藥物激活受體時(shí),這些位點(diǎn)可被G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRKs)和蛋白激酶C磷酸化［6］,而羧基端多位點(diǎn)磷酸化是促進(jìn)MOR脫敏和內(nèi)吞的關(guān)鍵因素［7］。本課題組前期基于MOR羧基端的375STANT379磷酸化位點(diǎn)設(shè)計(jì)并合成了多肽TAT-Q368-T379［8］,本研究以該多肽作為研究工具,探討MOR羧基端的375STANT379關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn)對(duì)受體下游G蛋白信號(hào)通路以及β-arrstin2信號(hào)通路的影響,為開發(fā)能夠與嗎啡聯(lián)用以增強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用的藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞與質(zhì)粒 HEK-293細(xì)胞購自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司,MOR質(zhì)粒來源于上海聯(lián)慧腦智工程研究中心,pGloSensorTM-22F cAMP質(zhì)粒購買于美國Promega公司,MOR-C端標(biāo)記Nanoluc質(zhì)粒、β-arrestin2-N端標(biāo)記EYFP質(zhì)粒由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.2試劑與儀器 醫(yī)用鹽酸嗎啡購買于東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司,DAMGO購買于美國AbMole公司,Forskolin購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司,Cmpd101購買于北京偶合科技有限公司,HA-Tag抗體購買于美國Cell Signaling technology公司,Alexa Fluor 555標(biāo)記的驢抗小鼠抗體購買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司,正置雙光子全光譜快速掃描共聚焦顯微鏡購買于日本Nikon公司。

1.2 HEK-293細(xì)胞培養(yǎng)

將HEK-293細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)0.10的胎牛血清和100 kU/L青霉素和鏈霉素(1∶1)混合液的DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),隔天傳代一次,待HEK-293細(xì)胞傳到第8代且細(xì)胞融合度約90%時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 GloSensor cAMP生物傳感器測定cAMP的含量

將HA-MOR質(zhì)粒與pGloSensorTM-22F質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染24 h后,在96孔板每孔接種100 μL的細(xì)胞懸液,培養(yǎng)24 h后丟棄培養(yǎng)基,換成平衡培養(yǎng)基(不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基和2%的GloSensor cAMP試劑原液)于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min,孵育完成后,將細(xì)胞分為6組并進(jìn)行如下處理:①A組:每孔加入100 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基;②B組:每孔加入90 μL不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基,然后加入溶解有10-5mol/L DAMGO的10 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基;③C組:每孔加入90 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基后分為7個(gè)亞組,各亞組加入含濃度10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L嗎啡(后文以濃度梯度10-11～10-5mol/L嗎啡代指)的10 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基;④D組:每孔加入80 μL不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基,然后加入溶解有0.5×10-5mol/L多肽TAT-Q368-T379的10 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基后,下設(shè)7個(gè)亞組,各亞組分別加入含濃度10-11～10-5mol/L嗎啡的10 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基;⑤E組:每孔加入80 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基,然后加入溶解有10-5mol/L多肽TAT-Q368-T379的10 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基后,下設(shè)7個(gè)亞組,各亞組分別加入含濃度10-11～10-5mol/L嗎啡的10 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基;⑥F組:每孔加入80 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基,然后加入溶解有2×10-5mol/L多肽TAT-Q368-T379的10 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基后,下設(shè)7個(gè)亞組,各亞組分別加入含濃度10-11～10-5mol/L嗎啡的10 μL無酚紅DMEM培養(yǎng)基。除A組外,B～F組每組分別加入含濃度10-5mol/L Forskolin的1 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基,孵育15 min,最后用多功能酶標(biāo)儀測定A～F組細(xì)胞全波長化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(LI)。通過計(jì)算藥物作用以后的cAMP抑制率以反映藥物對(duì)于MOR下游G蛋白依賴性信號(hào)通路的激活的程度,cAMP抑制率=［(LIForskolin組-LI空白組)-(LI藥物處理組-LI空白組)］/(LIForskolin組-LI空白組)×100%。每組分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3次,結(jié)果取均值。多肽TAT-Q368-T379由本課題組前期構(gòu)建［8］。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用分析法測定嗎啡激動(dòng)MOR后對(duì)β-arrestin2的募集效應(yīng)

將MOR-C端標(biāo)記Nanoluc的質(zhì)粒和β-arrestin2-N端標(biāo)記EYFP的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后,在96孔板每孔中接種100 μL的細(xì)胞懸液,于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。24 h后丟棄培養(yǎng)基,將細(xì)胞分為5組并進(jìn)行如下處理:①G組:每孔加入90 μL不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基;②H組:每孔加入80 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基,然后加入溶解有10-5mol/L DAMGO的10 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基;③I組:每孔加入80 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基以后,下設(shè)8個(gè)亞組,各個(gè)亞組分別加入含濃度10-11～10-4mol/L嗎啡的10 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基;④J組:每孔加入70 μL不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基,再加入溶解有10-5mol/L多肽TAT-Q368-T379的10 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基后,下設(shè)8個(gè)亞組,各亞組分別加入含濃度10-11～10-4mol/L嗎啡的10 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基;⑤K組:每孔加入70 μL不含酚紅的DMEM培養(yǎng)基,再加入溶解有3×10-5mol/L Cmpd101的10 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基后,下設(shè)8個(gè)亞組,各亞組分別加入含濃度10-11～10-4mol/L嗎啡的10 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基。G～K組每孔加入溶解有Nluc底物(1∶1 000)的10 μL不含酚紅DMEM培養(yǎng)基孵育3 min,然后使用多功能酶標(biāo)儀測定G～K組在波長460 nm處的LI以及540 nm處的熒光強(qiáng)度(FI)。計(jì)算每孔的凈BRET值以反映藥物對(duì)MOR下游β-arrestin2信號(hào)通路的激活的程度,凈BRET值=FI藥物處理組/LI藥物處理組-FI空白組/LI空白組。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取均值。

1.5 細(xì)胞免疫熒光染色法測定嗎啡激動(dòng)MOR后受體內(nèi)吞水平的變化

將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)HA-MOR的HEK-293細(xì)胞接種在放置于24孔板中的多聚賴氨酸包被的玻片上生長過夜。24 h后丟棄培養(yǎng)基,將識(shí)別MOR氨基端HA標(biāo)簽的一抗(1∶100)稀釋于DMEM培養(yǎng)基中并在37 ℃下培養(yǎng)細(xì)胞1 h,隨后將細(xì)胞分為4組并進(jìn)行如下處理:①L組:每孔加入2 mL DMEM培養(yǎng)基;②M組:每孔加入1.9 mL DMEM培養(yǎng)基,再加入含10-5mol/L嗎啡的100 μL DMEM培養(yǎng)基;③N組:每孔加入1.8 mL DMEM培養(yǎng)基,然后加入溶解有10-5mol/L多肽TAT-Q368-T379的100 μL DMEM培養(yǎng)基,再加入含10-5mol/L嗎啡的100 μL DMEM培養(yǎng)基;④O組:每孔之中加入1.8 mL的DMEM培養(yǎng)基,然后再加入溶解有3×10-5mol/L Cmpd101的100 μL DMEM培養(yǎng)基,再加入含10-5mol/L嗎啡的100 μL DMEM培養(yǎng)基。完成藥物處理后用40 g/L多聚甲醛固定L～O組細(xì)胞,將Alexa Fluor 555標(biāo)記的驢抗小鼠二抗(1∶500)稀釋于DMEM培養(yǎng)基中,然后孵育L～O組細(xì)胞1 h。通過熒光在共聚焦顯微鏡下對(duì)L～O組MOR進(jìn)行細(xì)胞定位,檢測細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度,以細(xì)胞表面受體熒光強(qiáng)度表示嗎啡激動(dòng)MOR后受體內(nèi)吞水平的變化。每組選用45～50個(gè)細(xì)胞,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism軟件處理數(shù)據(jù),得到量效關(guān)系曲線并擬合出各分組中嗎啡的效價(jià)參數(shù)半數(shù)最大有效濃度(EC50)和效能參數(shù)最大效應(yīng)(Emax)。使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組間EC50值、Emax值及半定量分析指標(biāo)差異比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 多肽TAT-Q368-T379對(duì)嗎啡激活MOR下游G蛋白依賴性cAMP信號(hào)通路的影響

通過C～F組及其7個(gè)亞組的cAMP抑制率擬合量效關(guān)系曲線得出,C～F組細(xì)胞EC50值分別為2.33±0.73、1.34±0.45、0.49±0.08、0.38±0.07,組間比較差異有顯著性(F=13.12,P<0.05);與C組比較,D、E、F組細(xì)胞的EC50值均顯著減小(P<0.05)。

2.2 多肽TAT-Q368-T379和Cmpd101對(duì)嗎啡激活MOR下游β-arrestin2信號(hào)通路的影響

通過I～K組及其8個(gè)亞組的凈BRET值擬合量效關(guān)系曲線得出,I～K組細(xì)胞的Emax值為0.23±0.00、0.17±0.01、0.12±0.00,組間比較差異具有顯著性(F=185.95,P<0.05),與I組比較,J、K組細(xì)胞的Emax值均顯著減小(P<0.01)。

2.3 多肽TAT-Q368-T379對(duì)嗎啡誘導(dǎo)的MOR內(nèi)吞的影響

共聚焦成像結(jié)果顯示,與L組相比,M組細(xì)胞可觀察到MOR發(fā)生明顯內(nèi)吞,而N、O組細(xì)胞內(nèi)吞的MOR明顯比M組減少(圖1)。L～O組細(xì)胞的表面受體熒光強(qiáng)度分別為100.00±13.11、81.28±10.56、92.58±12.86、93.72±13.30,組間比較差異有顯著性(F=17.46,P<0.05);與L組比較,M組細(xì)胞表面受體熒光強(qiáng)度顯著減小(P<0.01),與M組進(jìn)行比較,N、O組細(xì)胞表面受體熒光強(qiáng)度均顯著增高(P<0.01)。

圖1 各組HEK-293細(xì)胞中MOR內(nèi)吞水平的比較

3 討 論

MOR是一種Gi/o亞型的G蛋白偶聯(lián)受體。當(dāng)MOR與其激動(dòng)劑在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合后,活化的MOR通過Gα蛋白發(fā)出信號(hào),抑制腺苷酸環(huán)化酶活性并減少cAMP積累,通過G蛋白的βγ亞單位激活內(nèi)向整流K+通道和抑制電壓門控Ca2+通道,從而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用［9-10］,細(xì)胞內(nèi)活化的MOR也被GRKs磷酸化,導(dǎo)致β-arrestin2募集,從而啟動(dòng)MOR脫敏、內(nèi)吞和再循環(huán)過程［6］。研究發(fā)現(xiàn),β-arrestin2敲除小鼠表現(xiàn)為阿片類藥物誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛作用增強(qiáng),藥物耐受、呼吸抑制和便秘均得到改善［11-13］。后續(xù)關(guān)于β-arrestin2敲除小鼠的研究再次證實(shí)了MOR下游β-arrestin2信號(hào)通路對(duì)阿片類藥物的鎮(zhèn)痛作用及藥物耐受至關(guān)重要［14-15］,但是對(duì)呼吸抑制、便秘的作用具有一定爭議［7］。

MOR羧基端具有多個(gè)Ser、Thr關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn),受體下游信號(hào)通路傳導(dǎo)的效率能夠受到多位點(diǎn)的調(diào)節(jié)［16］。通過定量質(zhì)譜以及細(xì)胞生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn),375STANT379基序是阿片類藥物介導(dǎo)MOR磷酸化的關(guān)鍵位點(diǎn)［17］。有研究通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測MOR激動(dòng)劑誘導(dǎo)的Thr370和Ser375位點(diǎn)磷酸化證實(shí)了上述觀點(diǎn)［18］。阿片類藥物活化MOR后介導(dǎo)的受體羧基端位點(diǎn)磷酸化是分層次進(jìn)行的,首先是Ser375位點(diǎn)發(fā)生快速并且顯著的磷酸化,隨后則依次是Thr370、Thr379及Thr376位點(diǎn)的磷酸化［19-21］。最近有研究發(fā)現(xiàn),HEK-293細(xì)胞中GRK2以及GRK3能夠明顯促進(jìn)包括375STANT379位點(diǎn)在內(nèi)的MOR多位點(diǎn)磷酸化以及MOR內(nèi)吞［20-22］,并且Thr370、375STANT379位點(diǎn)對(duì)于MOR脫敏、內(nèi)吞以及β-arrstin2募集均是必要的［21］。

大部分研究通過使用轉(zhuǎn)基因小鼠間接證明了MOR羧基端375STANT379位點(diǎn)磷酸化在受體下游細(xì)胞信號(hào)通路中的作用,但這種情況下不能排除參與MOR調(diào)節(jié)的其他信號(hào)蛋白的磷酸化。本課題組前期根據(jù)MOR羧基端的375STANT379磷酸化位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成了多肽TAT-Q368-T379,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,多肽TAT-Q368-T379與嗎啡聯(lián)合使用時(shí),能夠明顯增強(qiáng)嗎啡的鎮(zhèn)痛作用,說明375STANT379磷酸化位點(diǎn)與嗎啡的鎮(zhèn)痛相關(guān)［8］。為探究多肽TAT-Q368-T379發(fā)揮作用的分子機(jī)制,本文研究了該多肽對(duì)嗎啡介導(dǎo)的MOR下游細(xì)胞信號(hào)通路的影響。

在本研究中,通過GloSensor cAMP生物傳感器檢測發(fā)現(xiàn),多肽TAT-Q368-T379與嗎啡聯(lián)用能夠使嗎啡的cAMP抑制率明顯增高,即多肽增強(qiáng)了MOR下游G蛋白信號(hào)通路的激活。說明多肽在一定程度上可以防止嗎啡脫敏的發(fā)生。這一結(jié)論也與本課題組前期的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致［8］。蛋白質(zhì)相互作用分析法和細(xì)胞免疫熒光染色法分析顯示,在HEK-293細(xì)胞中GRK2/3抑制劑Cmpd101能夠明顯減少嗎啡誘導(dǎo)的β-arrestin2募集和MOR內(nèi)吞,這也與既往研究的觀點(diǎn)一致［16,23］。同時(shí),本研究顯示,基于MOR羧基端375STANT379磷酸化位點(diǎn)設(shè)計(jì)的多肽TAT-Q368-T379可以起到與Cmpd101類似的作用,因此推測HEK-293細(xì)胞中多肽可能通過競爭性抑制375STANT379位點(diǎn)的磷酸化,從而阻止β-arrestin2募集和MOR內(nèi)吞。此機(jī)制可通過進(jìn)一步的蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。關(guān)于在動(dòng)物體內(nèi)β-arrestin2招募與阿片類藥物副作用的關(guān)系,包括藥物耐受、便秘和呼吸抑制等,也可進(jìn)一步將多肽與嗎啡聯(lián)合應(yīng)用于相關(guān)的動(dòng)物模型中進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述,基于本課題組前期所設(shè)計(jì)的多肽TAT-Q368-T379,本研究證實(shí)了該多肽干預(yù)能夠在MOR下游G蛋白信號(hào)通路和β-arrestin2信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用,此為增強(qiáng)阿片類藥物鎮(zhèn)痛作用及改善藥物副作用提供了新思路。

作者聲明：董河、董銘心、李笑妍參與了研究設(shè)計(jì);董銘心、李笑妍、周筱慧參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文,且均聲明不存在利益沖突。